Введение. Одним из глобальных вызовов современности являются зооантропонозы — инфекционные заболевания, передающиеся опосредованно и напрямую от животных человеку. На данный момент известно более 200 видов зоонозных инфекций, и их список постоянно пополняется. Важной проблемой для ветеринарии и медицины на территории Российской Федерации остается заболеваемость людей и животных бруцеллезом, который может проявиться в виде паралича, менингоэнцефалита, нейросенсорной глухоты и др., в зависимости от типа бактерии, ставшей причиной развития бруцеллеза [1–10]. По данным ряда исследователей эпизоотолого-эпидемиологической обстановки, на начало 2021 г. в России зарегистрированы 234 неблагополучных пункта по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота, а также зафиксированы случаи заболевания людей [11]. Причинами возникновения стойкой неблагополучной по бруцеллезу эпизоотической ситуации могут стать: несоблюдение ветеринарных требований и правил при содержании животных и реализации продукции животноводства, несвоевременный убой больных животных, невыявленные эпизоотические очаги и скрытые носители бруцелл.

Основными патогенными видами рода Brucella, способными вызывать серьезные эпизоотические и эпидемические осложнения, являются B. melitensis, B. abortus и B. suis [12]. Важнейшим инструментом в изучении морфологических особенностей бактериальных клеток является электронная микроскопия [13][14]. Так, исследования ряда авторов касаются ультраструктурных особенностей L-форм бруцелл [15][16]. Казахские ученые методом негативного контрастирования изучали S- и R-формы изолятов бруцелл [17]. Сотрудники ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) более 10 лет проводят исследования ультраструктурных особенностей бруцелл, включая воздействие на данные микроорганизмы факторов различной этиологии [18–21].

Действенным средством для предотвращения заболевания является вакцинация [22–25]. Однако на эффективность вакцины могут влиять различные факторы: условия производства, транспортировки, способ ее введения, но особенно — условия хранения. Выделяют следующие этапы подготовки вакцины: получение посевных культур, процесс накопления биомассы, розлив, заморозка, сублимационное высушивание (лиофилизация), герметизация и упаковка. Лиофилизация является оптимальным методом для длительного хранения культур, но этот этап экономически эффективен и безопасен только для производства инактивированных вакцин. Процесс лиофилизации вирулентных штаммов намного сложнее ввиду больших экономических затрат и трудоемкости, поэтому для длительного хранения живых культур зачастую используют глубокую заморозку. Чтобы нивелировать деструктивное воздействие заморозки на бактериальные клетки, их помещают в различные среды, однако в таком случае важно подтвердить сохранность их структур на морфологическом уровне. К сожалению, до сих пор не существует комплексных исследований влияния различных режимов глубокого замораживания на ультраструктуру Brucella suis с использованием современных методов морфологического анализа. Большинство существующих работ исследуют только выживаемость бактерий, что не подтверждается на ультраструктурном уровне. Цель данного исследования — провести морфологический анализ Brucella suis (штамм 22) для оценки влияния низкотемпературного хранения в различных условиях на ультраструктуру бактерий.

Материалы и методы. Исследование проведено в 2024 г. на базе лаборатории морфологических исследований и отдела Государственной коллекции штаммов микроорганизмов Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань). В качестве объекта исследований брали суспензии клеток Brucella suis (штамм 22), выращенных после хранения в разных условиях: 1 группа — нативный; 2 группа — лиофилизированный; 3 группа — в обезжиренном молоке при –40 °C; 4 группа — в обезжиренном молоке при –70 °C; 5 группа — в сахарозо-желатиновой смеси при –40 °C; 6 группа — в сахарозо-желатиновой смеси при –70 °C.

Обработка проб осуществлялась по разработанной авторами схеме: суспензии бактериальных клеток центрифугировали, осадок культуры трижды промывали, затем фиксировали в пробирках типа эппендорф раствором 2,5 % глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере. После двукратной промывки фосфатным буфером той же молярности проводили постфиксацию тетраоксидом осмия, дегидратацию в спиртах возрастающей концентрации, ацетоне и импрегнацию образцов смесью эпоновых смол с последующей полимеризацией [25].

Для ультраструктурного анализа образцы подготавливали по методике ультратонких срезов с помощью микротома LKB-III (Швеция). Полученные срезы монтировали на блендах с подложкой из пиолоформа, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, а после сушки просматривали на просвечивающем электронном микроскопе JEM 1100 (JEOL, Япония), масштабная линейка 200 нм. Полученные электронограммы подвергали морфометрическому анализу в программе ImageJ (сборка FIJI, США).

Статистическую обработку результатов осуществляли в программах Statistica 6.0 (США) и MS Excel. Попарное сравнение результатов, полученных на нативном штамме и штаммах, хранившихся в различных условиях, проводилось с использованием теста Манна–Уитни с исходным уровнем значимости α=0,05 и последующей коррекцией уровня значимости по методу Бонферрони (до α=0,002).

Результаты исследования. На электронограммах ультратонких срезов бактерии Brucella suis (штамм 22) всех групп округлые и палочкообразные (в зависимости от угла прошедшего среза), с четкими, немного волнистыми границами. Отмечается наличие единичных клеток неправильной формы с расширенным периплазматическим пространством, что можно связать с естественными процессами. Изредка просматриваются увеличенные клетки округлой формы и бактериальные клетки в процессе деления (рис. 1–3).

Результаты морфометрических исследований приведены в таблице 1.

Результаты исследований показали статистически значимые отличия (в сравнении с группой 1) по малому калиперометрическому диаметру в группе с применением лиофильной сушки, однако поскольку данные различия лежат в пределах стандартного отклонения средней величины показателя, следует охарактеризовать их как тенденцию. Параметры остальных групп не имели статистически значимых отличий от показателей нативной группы.

Обсуждение и заключение. По результатам оценки воздействия глубокой заморозки на ультраструктуру бактерий Brucella suis (штамм 22), выращенных в обезжиренном молоке и сахарозо-желатиновой среде, морфологических отличий от нативного штамма не обнаружено, что позволяет сделать вывод о предпочтительности хранения в данных средах. Некоторые отличия от нативного штамма зарегистрированы в группе с применением лиофильной сушки, но и они лежат в пределах стандартного отклонения средней величины показателя. В перспективе планируется исследование особенностей воздействия других сред хранения на ультраструктуру бактерий рода Brucella для пополнения данных в паспортах штаммов. Эта работа имеет также важное практическое значение для организации коллекций микроорганизмов и разработки диагностических средств.