Введение. Общая анестезия животных является неотъемлемым элементом не только ветеринарной практики, но и экспериментальных исследований лекарственных препаратов для ветеринарного применения. Лабораторный контроль в процессе осуществления анестезии является важным фактором ее успешного проведения [1]. Очевидно, что в силу своей специфики, необходимости применения сильнодействующих седативных и гипнотических средств, анестезия всегда представляет собой риск для лабораторных животных, особенно молодых, пожилых особей и животных с моделированными патологиями [2][3][4]. Осложнения в результате общей анестезии проявляются не только в виде ухудшения физиологических функций животного, состояния всех систем жизнеобеспечения, но и обострения патологического процесса, вплоть до летального исхода [5].

Согласно статистическим данным, плохая переносимость наркоза — весьма распространенное явление в ветеринарной практике [6]. Низкое качество выздоровления после общей анестезии у собак наблюдается в 29,1 % случаев, при этом 55,5 % из них необходима седация для контроля поведения [7]. Смертность больных животных в результате анестезии превосходит в 3,6 раза данный показатель в общей популяции животных (4,80 % против 1,35 %) [2], при этом у больных собак вероятность остановки сердца в результате анестезии в 23 раза выше, а вероятность смерти — в 24,5 раза больше, чем у здоровых [8]. Особое значение у больных животных имеет послеоперационная смертность, которая, по некоторым данным, достигает 47 % у собак, 61 % у кошек и 64 % у кроликов. В общей популяции животных летальности после анестезии и седации в наибольшей степени подвержены именно кролики, у которых риск смерти больше в 8 раз, чем у собак (1,39 % против 0,17 %) [9].

В настоящее время остро стоит проблема грамотного анестезиологического сопровождения при работе с животными, надлежащего обследования и выполнения рекомендаций, как в экспериментальных исследованиях, так и в ветеринарной медицине [10][11]. Особенно значима эта проблема при работе с мелкими грызунами, являющимися основными тест-системами в медико-биологических исследованиях, из-за их небольшого размера и особенностей метаболизма [12]. Возможности отечественных ученых в области экспериментальных ветеринарных исследований имеют существенные ограничения, связанные с доступом к современным технологиям, лекарственным препаратам и оборудованию, особенно при проведении контроля общей анестезии лабораторных грызунов. Таким образом, научный интерес представляет совершенствование подходов к осуществлению общей анестезии и лабораторному контролю ее проведения в экспериментальной практике для повышения безопасности животных.

Цель исследования — разработка и оптимизация методов контроля общей анестезии лабораторных животных для повышения эффективности и безопасности экспериментальных исследований новых ветеринарных препаратов.

Материалы и методы. Исследование проведено на базе научно-исследовательской лаборатории «Фармакология и экспериментальная патология» Института живых систем ДГТУ (г. Ростов-на-Дону) в период с января по май 2024 г. В эксперименте было задействовано 20 крыс линии Wistar обоих полов массой 300-400 г. Все животные содержались на стандартном рационе при свободном доступе к воде согласно действующим санитарным нормам [13].

При выполнении исследований придерживались общих принципов биоэтики [14] и Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета ЕС «О защите животных, используемых в научных целях» (Брюссель, 2010) [15]. Все манипуляции, вызывающие боль и страдания, и выведение животных из опыта проводились с использованием адекватной анестезии и аналгезии [16]. Протокол исследования был рассмотрен Локальным независимым этическим комитетом ДГТУ (заключение № 4 от 09.10.2023 г.).

Общую анестезию животных осуществляли с помощью наркозного аппарата для животных RWD R520 (RWD Life Science, США) и изофлурана (Laboratories Karizoo, S.A., Испания).

С помощью кардиореспираторного комплекса для мелких лабораторных животных «КОКС-2» (Medical Computer Systems Ltd., РФ) проводили электрокардиографию (ЭКГ) миокарда, оценивали частоту сердечных сокращений (ЧСС) и частоту дыхания (ЧД) [17][18]. Уровень артериального давления (АД) оценивали неинвазивным петизмометрическим методом [19] с помощью системы неинвазивного измерения кровяного давления грызунов «Систола» с подогревающей платформой «Флогистон» (ООО «Нейробиотикс», РФ). Интенсивность мозговой деятельности оценивали методом электроэнцефалографии (ЭЭГ) [20] с помощью компьютерного электроэнцефалографа для ветеринарии «Нейрон-Спектр-1В» (ООО «Нейрософт», РФ). Температуру (Т) тела животных оценивали с помощью ветеринарного ректального цифрового термометра Замер-1 в исполнении 2-ректальный (ООО «Замер», РФ). В ходе лабораторных наблюдений оценивали также педальный, глотательный и зрачковый рефлексы у животных.

Для оценки функционального состояния органов и систем животных до и после анестезии проводили ряд биохимических исследований крови и мочи. Кровь получали из хвостовой вены в количестве до 0,5 мл за одно взятие. В нативной крови определяли концентрацию глюкозы с помощью глюкометра OneTouch Verio Reflect (LifeScan Europe GmbH, Швейцария). В сыворотке крови с помощью наборов «Диакон-ДС» и спектрофотометра SPECTROstar Nano (BMG Labtech, Германия) определяли содержание креатинина, активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) [21]. Мочу получали с помощью обменных клеток («Открытая Наука», РФ) при длительности сбора 2 ч. В ней также определяли содержание креатинина, после чего рассчитывали скорость клубочковой фильтрации (СКФ) по клиренсу эндогенного креатинина [22].

Полученные результаты обрабатывали методами описательной статистики, проверяли на нормальность по критерию Шапиро-Уилка и представляли, как среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (M±m). Статистический анализ межгрупповых различий проводили методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки [23]. Вычисления производили с помощью программ IBM SPSS Statistics v. 22 (IBM Сorp., США) и MS Excel 2016 (Microsoft Corp., США). Различия показателей считали статистически значимыми при уровне вероятности p<0,05.

Результаты исследования. Общая ингаляционная анестезия по показателям эффективности и безопасности является наиболее предпочтительным подходом для экспериментальных исследований, поскольку позволяет полностью контролировать состояние животного с помощью сочетания двух основных параметров: концентрации ингаляционного анестетика и скорости подачи газовой смеси. Данный метод позволяет не только быстро ввести животное в гипнотическое состояние, но и мгновенно вывести, прекратив подачу газа, практически без негативных последствий. В связи с этим в представленной работе предложено усовершенствование методов лабораторного контроля именно для этого подхода.

Известно, что ингаляционные анестетики, особенно изофлуран, несут опасность для специалистов, постоянно контактирующих с ними в процессе работы [24]. Стандартные маски, входящие в комплектацию наркозного аппарата для животных RWD R520, не предполагают герметичности и характеризуются неизбежной утечкой газа. Для решения данной проблемы была сконструирована герметичная ингаляционная камера для крыс, которая позволяла использовать методы лабораторного контроля на основе съема электрофизиологических параметров. Объем камеры был рассчитан таким образом, чтобы обеспечить возможность установки ЭЭГ-электродов на поверхность головы животного и дыхательный датчик кардиореспираторного комплекса при минимальном рабочем объеме газовой смеси. При этом также сохранялась возможность установки ЭКГ-датчиков на туловище, манжеты для измерения артериального давления на хвост и ректального термометра в анальное отверстие животного. Реализация всех вышеперечисленных элементов контроля возможна только при использовании камеры, в которую помещается голова животного и свободной остается остальная часть тела, применение стандартных индукционных камер для ингаляционной анестезии с этой целью невозможно.

Камера была выполнена из прозрачного поликарбоната с наружными размерами 100×100×60 мм и внутренним объемом 500 см³ (рис. 1). Для подачи газовой смеси в камеру был использован штуцер стандарта DIN c внутренним диаметром 6 мм, а для отбора отработанного газа — штуцер стандарта 22М с внутренним диаметром 18 мм, которые располагались друг напротив друга, чтобы обеспечить однонаправленность газового потока, так чтобы в нем находились входные отверстия дыхательных органов животного. Соотношение сечения входящего и выходящего штуцеров 1:3 обеспечивало поток газовой смеси от точки ввода к точке отбора газа. На этапе конструирования и сборки ингаляционной камеры были использованы 6 особей.

Решением данной задачи также послужила не только сама конструкция камеры, способа ввода в нее верхней части тела животного, но и применение принудительного отбора газа из неё c помощью аппарата эвакуации газов и сменных газовых фильтров, входящих в комплектацию наркозного аппарата. Данные приспособления предназначены для поглощения и связывания излишков ингаляционного анестетика, тем самым обеспечивая безопасность работы. В текущем эксперименте применяли два эвакуационных аппарата RWD Life Science, имеющих функцию взвешивания газового фильтра: R546-Pro с принудительным отбором газа и R548 без него, с соответствующими газовыми фильтрами R510-31-6 и R510-31S-6.

В ходе общей анестезии животное подвергали воздействию изофлурана в индукционной камере, после чего укладывали на подогреваемый экспериментальный столик, фиксировали, помещали голову в ингаляционную камеру, накладывали ЭЭГ-электроды, устанавливали датчик дыхания, далее фиксировали ЭКГ-электроды, закрывали ингаляционную камеру и начинали подачу в нее газовой смеси (рис. 2). После этого хвост животного помещали на подогреваемый столик Флогистон, накладывали манжету для измерения АД и устанавливали ректальный термометр. В таком состоянии животное находилось в течение всей процедуры общей анестезии для осуществления лабораторного контроля, отработки данной методики и съема соответствующих физиологических показателей. Полученные данные подвергались анализу на предмет эффективности предложенных методов контроля и безопасности апробированного протокола общей анестезии.

В ходе выполнения исследования было применено два режима подачи наркоза — с использованием активного и пассивного отбора газов, при этом показатели концентрации и скорость подачи подбирались так, чтобы воздействие на животное было минимальным. В процессе подбора ориентировались на глубину наркоза крыс, определяя его стадии по состоянию животного, уровню рефлексов и физиологическим параметрам.

В результате было использовано два режима подачи газа:

1-й режим: концентрация изофлурана 2,0 %, скорость подачи 2,0 л/мин, скорость отбора 8,0 л/мин;

2-й режим: концентрация изофлурана 1,5 %, скорость подачи 2,0 л/мин, без принудительного отбора газа.

В соответствии с этими режимами было сформировано 2 группы животных по 7 голов, которые были подвергнуты воздействию общей анестезии с оценкой методов лабораторного контроля на основании снятых физиологических параметров.

В ходе исследования у животных, находящихся под ингаляционным наркозом, постоянно фиксировали электроэнцефалограмму (рис. 3) и с помощью программного обеспечения рассчитывали показатели ЭЭГ (таблица 1).

Для анализа ЭЭГ использовали общие показатели максимальной и средней амплитуд, а также показатели средних амплитуд пяти основных ритмов: дельта-ритма с частотой 0,5-3,0 Гц, тета-ритма (4,0-6,0 Гц), альфа-ритма (8,0-13,0 Гц), низких частот бета-диапазона (13,0-18,0 Гц) и высоких частот бета-диапазона (18,0-32,0 Гц) [20]. Анализ амплитуд спектров позволяет определить превалирующий тип ритма ЭЭГ и на основании этого сделать вывод о степени погружения животного в наркоз, ослаблении гипнотического действия анестетиков, или наоборот, избыточной глубине анестезии с опасностью летального исхода, а также зафиксировать момент развития агонального состояния или клинической смерти.

Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о большей глубине наркоза у крыс, получавших анестезию при 2-м режиме подачи газовой смеси, по сравнению с первой группой. Это подтверждается недостоверным снижением максимальной и средней амплитуд ЭЭГ, повышением превалирования дельта-ритма (р>0,05) и достоверным снижением амплитуд альфа- и бета-ритма высоких частот (р<0,05).

Кроме того, при проведении общей анестезии у крыс снимали кардиореспираторные параметры (рис. 4), а также показатели АД и температуры тела через 10 мин после индукции анестезии и через 30 мин — перед завершением эксперимента. Данные представлены в таблице 2.

Полученные результаты свидетельствуют, что при воздействии на животных общей анестезии при 2-м исследуемом режиме наблюдается достоверное снижение ЧСС на 18,5 %, вольтажа зубца R в 1,6 раза, а также частоты дыхания на 20,7 % (р<0,05). Данная картина говорит об угнетении функций сердечно-сосудистой и дыхательной систем, которое было более выраженным, чем в первой группе (таблица 2).

При этом во второй группе также наблюдалось достоверное снижение у животных систолического и среднего показателей АД на 16,7 % и 14,3 % соответственно (р<0,05). К концу эксперимента у крыс в этой группе показатель температуры тела достоверно снижался до 33,1 °С, что было статистически меньше, чем у животных первой группы (р<0,05). Это также свидетельствует о снижении функционального состояния сердечно-сосудистой системы, общем угнетении функций организма, что было более характерно для животных под 2-м режимом общей анестезии, и коррелирует с предыдущими показателями.

Помимо этого, перед началом и после проведения анестезии у животных определяли ряд биохимических параметров с оценкой функционального состояния почек, которые представлены в таблице 3.

Полученные данные показывают, что под воздействием общей анестезии при 1-м режиме подачи газовой смеси у животных не наблюдается статистически достоверной динамики основных биохимических показателей крови и функциональных показателей почек. Наблюдаются только отдельные тенденционные изменения. Это говорит о хорошем состоянии органов и систем, таких как печень, сердце и мочевыделительная система, после перенесенной общей анестезии. Данная картина свидетельствует о хорошей переносимости использованного анестезиологического протокола.

В то же время, при использовании 2-го режима введения газовой смеси наблюдалось достоверное снижение уровня гликемии на 21,7 % (р<0,05), повышение активности АлАТ в 1,7 раза (р<0,05), увеличение креатинина крови на 31,8 % (р<0,05), мочи — в 1,6 раза (р<0,05) и соответствующее падение уровня СКФ на 18,8 % (р<0,05). Все вышеизложенное говорит о поражении ряда органов и систем животных в результате проведения общей анестезии. Прежде всего, стоит отметить угнетение почечной функции, о чем свидетельствует показатель СКФ. А также активацию процессов цитолиза, что может возникнуть вследствие поражения печени под воздействием ингаляционного анестетика. Падение гликемии также укладывается в общую картину и свидетельствует об истощении животных в процессе проведения наркоза.

Данная картина коррелирует с результатами лабораторных наблюдений. Животные находились в очень глубокой стадии наркоза (ориентировочно 3-4), наблюдалось выраженное угнетение дыхания, которое становилось редким и глубоким, и сердечно-сосудистой функции. Показатели ЭЭГ также находились в угнетенном состоянии. В целом это свидетельствует о плохой переносимости 2-го режима наркоза при выбранной длительности его применения. Такое воздействие изофлурана может быть объяснено застоем газовой смеси в ингаляционной камере вследствие отсутствия принудительного отбора газа, снижением в ней содержания воздуха и, как следствие, парциального давления кислорода, что в итоге привело к глубокой гипоксии животных и, как следствие, к ухудшению резистентности органов и тканей к условиям данного анестезиологического режима.

Обсуждение и заключение. Полученные результаты демонстрируют высокую эффективность разработанного приспособления — ингаляционной камеры для крыс, подключаемой к наркозному аппарату, — для лабораторного контроля животных в процессе проведения общей анестезии ингаляционным методом. Анализ результатов говорит о выраженной корреляции электрофизиологических, функциональных и биохимических показателей животных, которые в комплексе дают возможность осуществить разностороннюю оценку безопасности анестезиологического протокола.

Таким образом, предложенная ингаляционная камера позволяет осуществлять контроль проведения общей анестезии с помощью электрофизиологических методов, которые являются объективными, чувствительными, высокоинформативными и хорошо коррелируют с результатами биохимических и функциональных исследований животных. Данный подход перспективен для внедрения в практику экспериментального изучения лекарственных препаратов для ветеринарного применения, может способствовать повышению качества результатов научно-исследовательской работы и облегчению задач исследователей.