Микробиоценоз влагалища у новотельных коров в климатических условиях Удмуртии

Введение. Различные микроорганизмы образуют микробиоценозы в системах организма, являясь симбионтной микрофлорой и синтезируя различные вещества для обменных процессов или защиты животных и человека. В послеродовой период в организме самки должно произойти четыре сопутствующих процесса до наступления следующей беременности: инволюция матки, регенерация эндометрия, восстановление циклирования яичников и контроль патогенных бактерий в матке [1]. Послеродовые заболевания матки связаны с выделением болезнетворных бактерий, в частности Escherichia coli, Trueperellapyogenes, Fusobacteriumnecroforum, Prevotella и Bacteroides. Причем данные микроорганизмы присутствуют в матке и во время беременности, но численность их невелика. В послеродовой период бактерии могут проникать в матку из влагалища, кожи и окружающей среды, а также попадать гематогенным путем, вызывая снижение фертильности или приводя к бесплодию [1–3].

Слизистая оболочка влагалища здоровой коровы заселена уравновешенным и динамичным составом аэробных, факультативно-анаэробных и облигатно-анаэробных микробов. Комменсальная микробиота играет ключевую роль в защите половых путей от патогенных микробов путем конкурентного воздействия [4]. Наиболее многочисленными бактериальными типами у голштино-фризского скота были представители Tenericutes, Firmicutes и Bacteroidetes. Затем в порядке уменьшения численности выявлены — Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacteria, Epsilonbacteraeota и Patescibacteria [5–8]. Также сообщается о еще двух родах, которых ранее не обнаруживали во влагалище молочных коров: Gallibacterium и Mannheimia [9].

По данным другого исследования у крупного рогатого скота наиболее распространены представители Bacteroidetes, Fusobacteria и Proteobacteria в половых путях. Коровы без маточных инфекций имеют во влагалище 15 таксонов, преимущественно Bacteroides и Enterobacteriaceae, а также Victivallis, Streptococcus, Phyromonadaceae, Alistipes, Coriobacteriaceae, Clostridium, Betaproteobacteria, Corynebacterineae, Cytophagaceae, Oscillibacter и Planctomycetaceae. Коровы с репродуктивными заболеваниями, характеризующимися гнойными выделениями из влагалища, имеют более разнообразный вагинальный микробиом, содержащий 68 таксонов, с преобладанием Bacteroides, Enterobacteriaceae, Histophilus, Alistipes, Flavobacteriaceae, Victivallis, Coriobacteriaceae, Streptococcus, Barnesiella и Oscillibacter [10]. Разница в выявляемых представителях микробиоценоза может быть связана с различиями в породе и возрасте изучаемых видов животных, их периоде эстрального цикла, географических условиях проживания, режиме питания и содержания [5][11].

Молочнокислые бактерии представляют собой большую группу разнообразных грамположительных бактерий, продуцирующих молочную кислоту. Она выступает в качестве основного конечного продукта ферментации углеводов, поэтому бактерии очень устойчивы к кислой pН среде [12]. Лактобактерии являются частью микробиоценоза влагалища в норме, которая вызывает местную иммунную реакцию [13–15]. Наличие на слизистой оболочке достаточного количества лактобактерий — важный фактор, обеспечивающий корректный уровень местных иммунных механизмов. Кроме того, выделяемая в процессе обмена веществ этих микроорганизмов молочная кислота поддерживает слабокислую pH во влагалище, что обуславливает защиту от колонизации слизистой оболочки разными условно-патогенными и патогенными микроорганизмами. Помимо этого, палочки Дедерляйна продуцируют перекись водорода, которая, являясь мощным окислителем, оказывает неспецифическое бактерицидное действие [16].

Ученые обнаружили, что представители Lactobacillus spp. преобладают в микробиоте коров, хотя и в низкой концентрации, редко превышая 1 % влагалищного микробиоценоза (в отличие от женщин, относительное количество лактобактерий во влагалище у которых обычно больше 70 %) [15]. Таким образом, они связали почти нейтральный рН, фиксируемый во влагалище коровы, с низкой численностью этого рода бактерий [2][16]. Микробиоту влагалища у животных можно разделить на пять основных типов состояния сообщества, в четырех из них преобладают лактобациллы. В I группе преобладает вид Lactobacillus crispatus, во II группе — L. gasseri, в III группе — L. iners и в IV группе — L. jensenii. В IV группе нет доминирования лактобацилл, но присутствует множество более строгих анаэробов [17].

Ранее было установлено, что вагинальные лактобациллы в дозе 10⁸–10⁹ КОЕ/мл способны снижать частоту гнойных выделений из влагалища, ускорять инволюцию матки и снижать частоту внутриутробных инфекций у молочных коров в перинатальный период [16]. Чаще при терапии используют штаммы лактобактерий. Однако существуют данные, что обаутопробиотические и гомологичные крысиные штаммы бифидобактерий при введении снижали популяцию стафилококков быстрее, чем в случае использования лактобацилл, однако при этом отмечали рецидивы заболеваний [18]. Бифидобактерии обладают широким набором факторов адгезии, что позволяет им успешно конкурировать в борьбе за сайты связывания на слизистой с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [19]. Помимо антагонистической активности бифидобактерии также обладают и антиоксидантной активностью: максимальные антиоксидантные свойства бифидобактерии проявляли при рН 5,78 [20].

Анализ различных научных источников по теме показал влияние множества факторов на формирование бактериальных сообществ в половом тракте коров, поэтому мы решили сосредоточиться на изучении и анализе микробиома влагалища у коров, проживающих в климатических условиях Удмуртской Республики, в зависимости от их физиологического статуса и сезонности.

Материалы и методы. Исследование проведено в 2023–2024 гг. на одном из животноводческих предприятий Удмуртской Республики. Объектом исследования стали новотельные коровы черно-пестрой голштинизированной породы. Всего исследовано 12 коров со среднесуточным удоем 22–29 л, с количеством лактаций 1–3, в возрасте 4–5 лет.

Для оценки структуры болезней исследуемого поголовья предварительно проведен ретроспективный анализ заболеваемости стада на основании ветеринарных отчетов предприятия.

Животных эксперимента наблюдали с 1-го по 7-й дни после отела в разные сезоны года (лето и зима). Для этого проводили осмотр слизистой оболочки влагалища с интервалом в два дня с соблюдением правил асептики, для осмотра использовали влагалищное зеркало с осветительным прибором и эндоскоп для визуального осеменения коров. Оценивали следующие показатели: цвет слизистой оболочки, наличие кровоизлияний, повреждений, характеристика лохий.

Для проведения микробиологического исследования на 4–5-й день наблюдения отбирали смывы со слизистой оболочки дорсолатеральной стенки влагалища. Использовали стерильную ватную палочку, которую помещали в транспортную среду Эймса. Микробиологическое исследование проводили путем посева смывов на мясо-пептонный агар (МПА), солевой агар для выделения стафилококков, среду Эндо, Клиглера и Бифидум. Культивировали в термостате при температуре 37 ºС в течение 1–3 суток, далее подсчитывали количество выросших колоний, описывали их и затем изготавливали мазки, окрашивая их по Граму согласно общепринятой методике. Микроскопию мазков осуществляли на микроскопе «БиоЛам» (АО «ЛОМО», Россия) с использованием иммерсионного объектива, ув. ×1000.

Результаты исследования. Анализ заболеваемости исследуемого стада за 2023 г. помог оценить степень распространения акушерско-гинекологических заболеваний у новотельных коров — данная группа болезней преобладает среди всех регистрируемых заболеваний в стаде и составляет 68,8 %. При этом структура акушерско-гинекологической группы болезней выглядит следующим образом: 44,4 % — болезни яичников, 41,6 % — метрит, 14 % — задержание последа.

В летний период результаты осмотра слизистой оболочки влагалища в первый день после отела характеризуются гиперемией в 55,5 % случаев. Кровоизлияния и повреждения слизистой оболочки влагалища отсутствуют. Выделения, обнаруживаемые на слизистой оболочке влагалища, также схожи у большинства коров и представляют собой густую мутную слизь с желтоватым оттенком и включениями разного цвета — красного, белого, серого. На 4-й день наблюдения у 16,6 % коров зафиксированы жидкие зловонные выделения, характерные для гнилостного метрита. В другом случае 16,6 % животных имели выделения в виде густой темно-красной слизи со слабым неприятным запахом, характерные для гнойно-катарального метрита. Коровы с физиологическим течением послеродового периода преобладали в исследовании — 66,6 %. Половина из них имела слизистые прозрачные выделения с незначительными включениями красного цвета, другая половина — только прозрачные слизистые выделения.

В зимний период уже на 4-5-й день после отела консистенция выделений изменялась: в 83 % случаев они становились жидкими. Цвет выделений и включений в них отличались разнообразием — от белого и розового цвета до желтого и коричневого. Зловонный запах присутствовал у 16,6 % исследуемых коров. Таким образом, в зимний период выделены коровы с гнилостным (22,2 %) и гнойно-катаральным метритом (44,4 %). Выделения животных с отсутствием осложнений послеродового периода были слизистыми, темно-красного цвета, но имели разжиженную консистенцию.

Для оценки микробиома влагалища смывы высевали на питательные среды (МПА, среду Эндо, Клиглера, солевой агар, среда Бифидум). На среде Эндо отмечали рост колоний малинового цвета, диаметром от 1 до 4 мм, округлой формы, с гладкой поверхностью, ровными краями (риc. 1а). При микроскопии находили грамотрицательные палочки (рис. 1б). Проводили пересев на среду Клиглера, где через 24 ч после инкубации наблюдали изменение цвета среды на желтый цвет и газообразование (рис. 2). Полученные результаты указывают на наличие кишечной палочки (E. coli).

На солевом агаре отмечен рост колоний диаметром от 1 до 5 мм, белого цвета, выпуклых, с ровным краем и гладкой поверхностью. При микроскопии визуализировали грамположительные кокки, формирующие скопление неправильной формы (рис. 3). Это указывает на наличие бактерий рода Staphylococcus.

На мясо-пептонном агаре обнаружено большое количество разнообразных колоний. При проведении визуальной оценки выявили колонии белого цвета, неправильной формы, с ровными краями и гладкой поверхностью, диаметром до 4 мм. Также были обнаружены плоские, складчатые колонии ризоидной формы серовато-белого цвета с коричневым оттенком, диаметром до 2 см. При микроскопии двух образцов с разных колоний обнаружены грамположительные палочки, представленные бациллами (рис. 4).

На среде Бифидум отмечался рост в виде «комет», «гвоздиков», «зерен» различной степени четкости (рис. 5). В мазках визуализировались грамположительные палочки, слегка изогнутые, в виде скоплений.

Количество мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в исследуемых группах в летний и зимний периоды было примерно одинаковым (таблица 1). Можно отметить, что содержание бактерий рода Staphylococcus было выше летом, относительно зимы, в 6,5 раз. У отдельных животных данный показатель составлял 44 КОЕ/мл, а в зимний период количество бактерий варьировалось от 1 до 11 КОЕ/мл. Аналогичная ситуация с кишечной палочкой, содержание которой в летний период было выше зимнего в 9 раз. В летнем периоде исследования только у 16,6 % коров присутствовал рост бифидобактерий в разведении 10¹. В зимнем же исследовании у 83,3 % коров наблюдали рост бифидобактерий в разведении 10⁷, у 16,6 % — в разведении 10⁴. Таким образом, в среднем зимой количество бактерий семейства Bifidobacteriaceae увеличивается относительно летнего периода до 10⁷ КОЕ/мл.

У коров, больных метритом, в летний период КМАФАнМ был на уровне 443 КОЕ/мл, что в 4,9 раза больше относительно зимы. Содержание бактерий летом варьировалось от 13 до 877 КОЕ/мл, а зимой — от 68 до 109 КОЕ/мл.

У больных животных в летний период из условно-патогенных регистрировалось больше E. coli, чем в зимний период, и данный показатель составлял 446,3±437,8 КОЕ/мл. Так, у одной из коров с острым метритом в летний период количество кишечной палочки по сравнению с другими животными составило 1322 КОЕ/мл, также общее количество бактерий относительно других животных — 877 КОЕ/мл.

В зимний же период наблюдали повышение количества бактерий рода Staphylococcus в 6 раз по сравнению с летними данными. У одной коровы с острым метритом количество бактерий рода Staphylococcus составило 103 КОЕ/мл относительно других животных, у которых данный показатель был на уровне 20–25 КОЕ/мл.

У коров, больных острым метритом, в летний период количество микроорганизмов составляло 443 КОЕ/мл, что на 80,3 % больше, чем у здоровых коров. Также данный показатель был выше на 79,6 %, чем у больных животных в зимний период.

В летний период содержание бактерий рода Staphylococcus выше у клинически здоровых коров, но можно отметить, что количество кишечной палочки выше у животных с метритом. В зимний период отмечается другая тенденция: бактерий кишечной палочки в обеих группах на одном уровне, а стафилококков больше у животных с метритом (49 КОЕ/мл).

Обсуждение и заключение. Проведенное исследование показало, что представители нормофлоры, а также условно-патогенной микрофлоры присутствуют на слизистой оболочке влагалища как больных метритом коров, так и здоровых (рис. 6). Поэтому основная масса работ, посвященных изучению микрофлоры влагалища коров, ориентирована на определение ее роли в этиологии, разработку диагностических подходов и оценку эффективности лечения акушерской патологии [12][21].

У коров с физиологическим течением послеродового периода отметили присутствие бактерий рода Staphylococcus и E. coli. В летний период количество данных микроорганизмов выше (26,0±10,1 КОЕ/мл и 9,0±5,0 КОЕ/мл соответственно), чем зимой (4,0±3,5 КОЕ/мл и 1,0±0,3 КОЕ/мл соответственно), что обусловлено более благоприятными условиями для сохранения бактерий во внешней среде. У любой самки молочного и мясного скота после отела увеличивается бактериальное разнообразие матки, но лишь у части развиваются субклинические или клинические заболевания [9]. Защита полости матки со стороны влагалища и шейки матки способствует снижению разнообразия микробиома матки. При этом высокое разнообразие микробиоты влагалища по сравнению с маткой объясняется ее близостью к внешней среде [22].

В зимний период в исследуемом стаде чаще наблюдали изменения выделений из половых путей, характерные для метрита, однако как в летний, так и в зимний период типы экссудата при воспалительных процессах совпадали. При этом во влагалище в 55,5 % случаев отмечали гиперемию слизистой оболочки, но воспалительный процесс не наблюдался. Можно отметить изменение содержания условно-патогенных микроорганизмов на слизистой влагалища. Так, летом увеличивается количество кишечной палочки относительно стафилококков, это можно объяснить их конкуренцией между собой. Зимой данный показатель снижается, как и у здоровых животных, что указывает на неблагоприятные условия для E. coli в данный период, при этом бактерии рода Staphylococcus начинают превалировать над кишечной палочкой.

Также выделили распространенную группу симбионтных микроорганизмов, которые относят к домену Bacteria, типу Actinobacteria, классу Actinobacteria, порядку Bifidobacteriales, семейству Bifidobacteriaceae, роду Bifidobacterium [19]. Отмечено наличие антагонистического взаимодействия между бифидобактериями и кишечной палочкой. Летом содержание бактерий рода Bifidobacterium было низким, а зимой их содержание увеличивалось, при этом количество E. coli уменьшалось.

Некоторые из наиболее важных механизмов действия симбионтных микроорганизмов, которые приносят пользу хозяину, включают: усиление барьерных функций эпителия; образование биопленок на слоях слизистой оболочки; предотвращение адгезии возбудителей; конкуренцию за основные питательные вещества; производство противомикробных соединений; модуляцию иммунной системы; изменение рН влагалища [2][13][22].

Антагонистический эффект бифидобактерий обусловлен продукцией ими, в ходе своей жизнедеятельности, молочной и уксусной кислот, которые, в свою очередь, снижают рН, препятствуя развитию патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Помимо кислот, бифидобактерии в процессе своего роста и развития накапливают и продуцируют антимикробные вещества — бактериоцины (бифидин, бифилонг), которые также оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие на патогенную микрофлору [20].

На состав влагалищной микрофлоры влияют различные факторы. В нашем случае можно отметить, что на такое разнообразие и количество микроорганизмов повлияла температура окружающей среды, условия содержания, несоблюдение санитарно-гигиенических условий при родовспоможении. У животных с метритом выявили увеличение количества условно-патогенных микроорганизмов на слизистой оболочке влагалища: в зимний период это были бактерии рода Staphylococcus, летом — E. coli. Данные результаты подтверждаются, тем, что летом экссудат носил катаральный характер, а зимой регистрировали преимущественно гнойные выделения.

Миграция микрофлоры по половому тракту в вышерасположенные органы по отношению к влагалищу возможна в случаях открытия цервикального канала. Данная ситуация складывается при состояниях течки и охоты во время полового цикла, во время родов и ранний послеродовой период. Поэтому в эти периоды возможна активная миграция микрофлоры как из влагалища в матку, так и в обратном направлении [8].

Понимание функциональной роли бактериальных сообществ в репродуктивных путях крупного рогатого скота позволяет получить важные данные для объяснения взаимосвязи этих факторов с плодотворным осеменением животных. Кроме того, полученные результаты позволяют находить новые, более экологичные варианты терапии и профилактики заболеваний репродуктивного тракта.