H2S-зависимые механизмы экспрессии и локализации каспазы-3 в клетках головного мозга мышей при черепно-мозговой травме

Введение. Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является распространенной нейротравмой среди животных. ЧМТ вызывает сложный каскад патологических процессов: первичное повреждение мозга переходит во вторичное, связанное с воспалением, окислительным стрессом, эксайтотоксичностью и апоптозом. Вторичное повреждение усугубляет состояние после травмы. В этой связи особый интерес представляет роль газотрансмиттера сероводорода (H₂S), который участвует в нейромодуляции, противовоспалительных, антиоксидантных и антиапоптотических процессах в центральной нервной системе. Важным элементом апоптоза при ЧМТ является каспаза-3. H₂S потенциально может модулировать экспрессию и активность каспазы-3, влияя на выживание нервных клеток и восстановление мозга после ЧМТ. Однако H₂S-зависимые механизмы регулирования каспазы-3 при травматическом повреждении до конца не изучены. Цель статьи — исследовать роль H₂S в экспрессии и локализации каспазы-3 в нейронах и астроцитах головного мозга мышей при ЧМТ.

Материалы и методы. Исследования проводились на кафедре «Биоинженерия» ДГТУ (г. Ростов-на-Дону) в условиях, соответствующих международным и национальным стандартам, в период c 20 апреля по 1 июня 2024 г. Объект исследования — 36 взрослых самцов мышей, поделенных на три группы: контрольную и две экспериментальные. Моделирование ЧМТ проводилось путем сброса груза (200 г) на необнаженный череп под анестезией хлоралгидратом. Донор H₂S сульфид натрия (Na₂S), способный эффективно высвобождать H₂S, либо ингибитор (аминооксиуксусная кислота, AOAA) цистатионин-β-синтазы (CBS), фермента, ответственного за эндогенный синтез H₂S, — вводились ежедневно после ЧМТ в течение 7 дней до выведения животных из эксперимента. Использование Na₂S и AOAA позволяло эффективно модулировать уровень эндогенного Н2S в головном мозге. Контрольной группе вводили физиологический раствор. Срезы мозга, фиксированные в 4 % PFA, инкубировались с антителами к каспазе-3 и нейрональному ядерному маркеру NeuN либо к астроцитарному маркеру GFAP. Колокализация оценивалась с помощью программы ImageJ. Анализ экспрессии каспазы-3 проводился в пенумбре мозга методом вестерн-блота с использованием первичных антител к каспазе-3 и β-актину и вторичных антител IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, детекция — хемилюминесцентным методом.

Результаты исследования. Изначальный уровень каспазы-3 в клетках головного мозга исследуемых мышей был низким. ЧМТ индуцировала экспрессию каспазы-3 в нейронах и глиальных клетках ипсилатерального поврежденного полушария через 7 дней во всех группах после травмы. Использование донора Na₂S приводило к снижению уровня каспазы-3 в нейронах на 32 %, тогда как ингибитор AOAA вызывал его увеличение на 31 % относительно травмированных нервных клеток контрольной группы, которой вводили физиологический раствор, об этом свидетельствуют показатели коэффициента M1 колокализации каспазы-3-положительных клеток с маркером нейрональных ядер NeuN. Аналогичные эффекты были продемонстрированы и на астроцитах, которые визуализировались с помощью специфичного астроцитарного маркера GFAP. Вестерн-блот анализ подтвердил эти данные, показывая значительное снижение уровня каспазы-3 при использовании Na₂S и его увеличение при введении AOAA через 7 дней после ЧМТ.

Обсуждение и заключение. Результаты исследования демонстрируют, что ЧМТ приводит к значительной активации каспазы-3 в нейронах и астроцитах поврежденного полушария головного мозга мышей, отражая развитие апоптоза в ответ на травматическое повреждение. Применение Na₂S эффективно снижало уровень каспазы-3, указывая на его нейропротекторное и антиапоптотическое действие. В то же время введение AOAA индуцировало увеличение экспрессии каспазы-3, подтверждая важную роль CBS и, соответственно, H₂S в регуляции клеточной гибели после ЧМТ. Надежность этих наблюдений была подтверждена как иммуногистохимически, так и методом вестерн-блот анализа. Полученные данные помогут лучше понять фундаментальные H₂S-зависимые сигнальные механизмы выживания и гибели нейронов и глиальных клеток при травматическом повреждении нервной системы, а ингибитор CBS и донор H₂S, использованные в нашем исследовании, могут лечь в основу разработки клинически эффективных нейропротекторных препаратов.

1. Maas AIR, Menon DK, Manley GT, Abrams M, Åkerlund C, Andelic N, et al. Traumatic Brain Injury: Progress and Challenges in Prevention, Clinical Care, and Research. Lancet Neurology. 2022;21(12):1004–1060. https://doi.org/10.1016/S1474-4422(22)00309-X

2. Capizzi A, Woo J, Verduzco-Gutierrez M. Traumatic Brain Injury: An Overview of Epidemiology, Pathophysiology, and Medical Management. Medical Clinics of North America. 2020;104(2):213–238. https://doi.org/10.1016/j.mcna.2019.11.001

3. Ladak AA, Enam SA, Ibrahim MT. A Review of the Molecular Mechanisms of Traumatic Brain Injury. World Neurosurgery. 2019;131:126–132. https://doi.org/10.1016/j.wneu.2019.07.039

4. Rodkin S, Nwosu C, Sannikov A, Raevskaya M, Tushev A, Vasilieva I, et al. The Role of Hydrogen Sulfide in Regulation of Cell Death Following Neurotrauma and Related Neurodegenerative and Psychiatric Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(13):10742. https://doi.org/10.3390/ijms241310742

5. Rodkin S, Nwosu C, Sannikov A, Tyurin A, Chulkov VS, Raevskaya M, et al. The Role of GasotransmitterDependent Signaling Mechanisms in Apoptotic Cell Death in Cardiovascular, Rheumatic, Kidney, and Neurodegenerative Diseases and Mental Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(7):6014. https://doi.org/10.3390/ijms24076014

6. Sun J, Li X, Gu X, Du H, Zhang G, Wu J, et al. Neuroprotective Effect of Hydrogen Sulfide against GlutamateInduced Oxidative Stress Is Mediated via the p53/Glutaminase 2 Pathway after Traumatic Brain Injury. Aging. 2021;13(5):7180–7189. https://doi.org/10.18632/aging.202575

7. Zhang J, Zhang S, Shan H, Zhang M. Biologic Effect of Hydrogen Sulfide and Its Role in Traumatic Brain Injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2020;2020(1):7301615. https://doi.org/10.1155/2020/7301615

8. Chen D, Fang Y-L, Zhang L-L, Niu X-Y, Sun X-R, Niu X-Z, et al. Hydrogen Sulfide Ameliorates IsofluraneInduced Cognitive Impairment in Mice: Implication of Caspase-3 Activation. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 2020;19(4):773–780. https://doi.org/10.4314/tjpr.v19i4.14

9. Yang G, Sun X, Wang R. Hydrogen Sulfide‐Induced Apoptosis of Human Aorta Smooth Muscle Cells via the Activation of Mitogen‐Activated Protein Kinases and Caspase‐3. FASEB Journal. 2004;18(14):1782–1784. https://doi.org/10.1096/fj.04-2279fje

10. Kobayashi C, Yaegaki K, Calenic B, Ishkitiev N, Imai T, Ii H, et al. Hydrogen Sulfide Causes Apoptosis in Human Pulp Stem Cells. Journal of Endodontics. 2011;37(4):479–484. https://doi.org/10.1016/j.joen.2011.01.017

11. Ryazantseva NV, Novitsky VV, Starikova EG, Kleptsova LA, Jakushina VD, Kaigorodova EV. Role of Hydrogen Sulfide in the Regulation of Cell Apoptosis. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2011;151:702–704. https://doi.org/10.1007/s10517-011-1420-y

12. Rodkin S, Nwosu C, Raevskaya M, Khanukaev M, Bekova K, Vasilieva I, et al. The Role of Hydrogen Sulfide in the Localization and Expression of p53 and Cell Death in the Nervous Tissue in Traumatic Brain Injury and Axotomy. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(21):15708. https://doi.org/10.3390/ijms242115708

13. Fletcher PA, Scriven DRL, Schulson MN, Moore EDW. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophysical Journal. 2010;99(6):1996–2005. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2010.07.006

14. Zhang L-M, Jiang C-X, Liu D-W. Hydrogen Sulfide Attenuates Neuronal Injury Induced by Vascular Dementia Via Inhibiting Apoptosis in Rats. Neurochemical Research. 2009;34:1984–1992. https://doi.org/10.1007/s11064-009-0006-9

15. Mooney SM, Miller MW. Expression of Bcl-2, Bax, and Caspase-3 in the Brain of the Developing Rat. Developmental Brain Research. 2000;123(2):103–117. https://doi.org/10.1016/S0165-3806(00)00081-X

16. Alam M, Alam S, Shamsi A, Adnan M, Elasbali AM, Al-Soud WA, et al. Bax/Bcl-2 Cascade Is Regulated by the EGFR Pathway: Therapeutic Targeting of Non-Small Cell Lung Cancer. Frontiers in Oncology. 2022;12:869672. https://doi.org/10.3389/fonc.2022.869672

17. Luo Y, Yang X, Zhao S, Wei C, Yin Y, Liu T, et al. Hydrogen Sulfide Prevents OGD/R-Induced Apoptosis via Improving Mitochondrial Dysfunction and Suppressing an ROS-Mediated Caspase-3 Pathway in Cortical Neurons. Neurochemistry International. 2013;63(8):826–831. https://doi.org/10.1016/j.neuint.2013.06.004

18. Thayyullathil F, Chathoth S, Hago A, Patel M, Galadari S. Rapid Reactive Oxygen Species (ROS) Generation Induced by Curcumin Leads to Caspase-Dependent and -Independent Apoptosis in L929 Cells. Free Radical Biology and Medicine. 2008;45(10):1403–1412. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2008.08.014

19. Rodkin SV, Nwosu CD. Role of Nitric Oxide and Hydrogen Sulfide in Neuronal and Glial Cell Death in Neurodegenerative Processes. Biologičeskie membrany. 2023;40(5):306–327. https://doi.org/10.31857/S0233475523050067

20. Ye X, Li Y, Lv B, Qiu B, Zhang S, Peng H, et al.. Endogenous Hydrogen Sulfide Persulfidates Caspase-3 at Cysteine 163 to Inhibit Doxorubicin-Induced Cardiomyocyte Apoptosis. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022;(1):6153772. https://doi.org/10.1155/2022/6153772

21. Corsello T, Komaravelli N, Casola A. Role of Hydrogen Sulfide in NRF2and Sirtuin-Dependent Maintenance of Cellular Redox Balance. Antioxidants. 2018;7(10):129. https://doi.org/10.3390/antiox7100129

22. Yang G, Zhao K, Ju Y, Mani S, Cao Q, Puukila S, et al. Hydrogen Sulfide Protects Against Cellular Senescence via S-Sulfhydration of Keap1 and Activation of Nrf2. Antioxidants and Redox Signaling. 2013;18(15):1906–1919. https://doi.org/10.1089/ars.2012.4645

23. Huang Y-Q, Jin H-F, Zhang H, Tang C-S, Du J-B. Interaction among Hydrogen Sulfide and Other Gasotransmitters in Mammalian Physiology and Pathophysiology. In: Zhu YC. (Ed.) Advances in Hydrogen Sulfide Biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. Vol 1315. Singapore: Springer; 2021. P. 205–236. https://doi.org/10.1007/978981-16-0991-6_9