Основные показатели функционирования сердечно-сосудистой системы лабораторных кроликов

Введение. Электрофизиологические исследования являются важным инструментом для оценки функционирования сердечно-сосудистой системы (ССС). Будучи неотъемлемой частью процесса изучения фармакологической безопасности новых лекарственных препаратов, эти исследования помогают оценить фармакологическую активность потенциальных терапевтических средств. Наиболее часто используемыми видами животных в экспериментальной электрофизиологии сердца являются мыши, морские свинки, крысы, карликовые свиньи, хорьки, кролики, собаки и обезьяны. Электрокардиограмма (ЭКГ) мышей и крыс демонстрирует существенные различия с человеческой, в том числе в процессе образования импульсов сердца, в связи с чем механизмы аритмии могут отличаться от таковых у людей. Кроме того, малые размеры сердца грызунов затрудняют хирургические вмешательства на этом органе и препятствуют их использованию для тестирования сердечных устройств, таких как протезы клапанов или кардиостимуляторы [1]. Кролики, хорьки, собаки и карликовые свиньи демонстрируют сходство распределения сердечных ионных каналов с сердцем человека, поэтому подходят для изучения реполяризации желудочков или про- и антиаритмических эффектов лекарственных средств¹ [2][3]. В то же время размер и схожие с человеком процесс образования импульсов сердца и метаболизм липопротеинов привели к широкому использованию лабораторных кроликов в качестве тест-систем для изучения сердечно-сосудистых заболеваний человека [4–6]. В настоящее время лабораторных кроликов часто используют для изучения генетических кардиомиопатий человека и синдрома удлиненного интервала QT [7], а также механизмов нарушения проводимости сердца и аритмий [1][8].

Следует отметить, что одним из необходимых подходов исследования ССС является способность лекарственного препарата замедлять реполяризацию желудочков (удлинять интервал QT)². В прошлом было замечено, что некоторые лекарственные средства могут приводить к тяжелым жизнеугрожающим аритмиям (например, пируэтной тахикардии), которые могут заканчиваться летальным исходом. В частности, такие свойства были обнаружены у цизаприда и терфенадина, которые из-за этого были выведены с рынка. Оценка влияния лекарственных препаратов на реполяризацию желудочков сердца и аритмогенный риск являются предметом активного изучения на доклиническом и клиническом этапе разработки лекарственных препаратов³.

Определение показателей ССС наиболее часто проводится при определении профиля фармакологической безопасности, где лабораторных кроликов используют как второй вид животных (негрызуны)⁴ [9]. В открытом доступе можно обнаружить средние значения или интервалы значений показателей ЭКГ, в том числе частоту сердечных сокращений (ЧСС), и артериального давления (АД), полученные у небольшого количества кроликов контрольной группы, а также у домашних кроликов. Однако в открытых источниках практически нет сводных данных референтных значений параметров ССС по разным породам кроликов, также крайне скудно представлены изменения, встречаемые при записи ЭКГ здорового кролика.

Цель работы — определить особенности ЭКГ и референтные интервалы основных показателей ССС (ЭКГ и АД) у половозрелых лабораторных кроликов разных пород, возраста и пола, а затем сравнить полученные данные с литературными источниками.

Материалы и методы. Все исследования были проведены в АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» (Ленинградская область) в период с 2019 по 2024 гг. и соответствовали принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей⁵, и правилам надлежащей лабораторной практики⁶. Для изучения влияния препаратов на сердечно-сосудистую систему оценивали: артериальное давление, частоту сердечных сокращений и электрокардиограмму; также проводили обзор данных, полученных in vivo, in vitro и/или ex vivo, включая методы оценки нарушений реполяризации и проведения в миокарде^{7,8,9,10,11,12}. Данные для расчета референтных интервалов АД и параметров ЭКГ были получены при регистрации фоновых значений у всех кроликов в эксперименте (до введения исследуемых препаратов), а также у кроликов, находившихся в контрольных и интактных группах.

Регламентирующие документы по проведению доклинических исследований описывают основной набор исследований фармакологической безопасности, целью которого является изучение влияния исследуемого вещества на жизненно важные функции организма человека (сердечно-сосудистую, центральную нервную и дыхательную системы)^{13,14,15,16,17}. Данные исследования проводились до начала клинической разработки в соответствии с принципами, изложенными в руководствах ICH S7A и S7B^18,19. При необходимости дополнительные и последующие исследования фармакологической безопасности могут быть проведены на поздних стадиях клинической разработки¹⁵.

В свою очередь, дополнительные исследования ССС направлены на более глубокое понимание полученных результатов жизненно важных функций, например: измерение сердечного выброса, сократимости желудочков, сопротивляемости сосудов^20,21,22. Для оценки дополнительных параметров в качестве уточняющего исследования в основном рассматривают проведение эхокардиографии [10][11].

Во всех проведенных экспериментах использовали кроликов пород советская шиншилла, белый великан и новозеландская в возрасте от 4 до 8 месяцев, предоставленных питомниками, имеющими необходимую ветеринарно-сопроводительную документацию. Животных содержали в одинаковых стандартных условиях: температура воздуха 15–22 °С, относительная влажность > 45 %, 12-часовой световой день. Были использованы небеременные и нерожавшие самки. Кролики содержались индивидуально или попарно (один пол) в стандартных пластиковых клетках на древесном подстиле, а также группами не более 5 особей одного пола в изолированных боксах, со съемным панельным полом. Площадь пола клетки содержания на одно животное соответствовала Руководству по содержанию и использованию лабораторных животных²³. Доступ к воде не ограничивали на протяжении всего срока каждого эксперимента. Кормление животных проводили два раза в день, утром и вечером, в соответствии с Директивой 2010/63/EU²⁴ и Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных²⁵. В качестве корма использовали комбикорм для грызунов, приготовленный в соответствии с требованиями ГОСТ 34566–2019²⁶.

Несмотря на то, что предпочтительнее при проведении физиологических исследований использовать бодрствующих животных, допускается применение анестезии для нивелирования возможной вариативности параметров, обусловленной стрессом, двигательной активностью животных²⁷. В литературных источниках отмечается, что использование на кроликах таких анестезирующих препаратов, как тилетамин/золазепам, в комбинации с ксилазином дает относительно незначительные побочные эффекты при достаточной глубине наркоза для исследования [12–14]. Наркотизацию животных осуществляли при помощи внутримышечного или внутривенного введения препарата, содержащего тилетамин и золазепам, в комбинации с ксилазина гидрохлоридом в дозах 5 мг/кг и 1–2 мг/кг соответственно.

Регистрацию АД и ЭКГ проводили в различные временные интервалы в течение дня у наркотизированных животных в положении на спине. После подтверждения отсутствия рефлексов у животного проводили регистрацию ЭКГ с помощью компьютерного электрокардиографа для ветеринарии «Поли-спектр-8/Е» (ООО «Нейрософт», Россия), ЭКГ записывалась в течение 1 минуты в трех базовых и шести грудных отведениях. При анализе ЭКГ оценивали следующие показатели: частота сердечных сокращений (ЧСС, удары/мин), RR (мс), P (мс), PQ (мс), QRS (мс), QT (мс), а также амплитуда зубцов R и T (мВ). Продолжительность интервалов и зубца P оценивали в трех базовых отведениях (I, II и III), как наиболее часто применяемых и визуализируемых при оценке патологий ССС [15][16], амплитуда зубцов измерялась в отведении II как усредненном. При этом продолжительность интервалов в подавляющем большинстве случаев совпадала в двух отведениях, за редкими исключениями, когда продолжительность была различной, измерение проводили по отведению с наибольшей продолжительностью (чаще в отведении II).

После проведения электрокардиографии у животных измеряли артериальное давление, включающее в себя систолическое и диастолическое значения, неинвазивным методом при помощи манжеты и ветеринарного монитора давления Zoomed BPM-2 (ООО «ЗООМЕД», Россия). Манжету накладывали на грудную правую или левую конечности, измерение проводили три раза с интервалом от 1 до 3 минут между каждым, затем вычисляли среднее значение показателей САД и ДАД. Некорректные выскакивающие значения прибора (изменение показателей более чем на 20 единиц относительно измеренных ранее значений) не учитывали и сразу перерегистрировали.

Значения измеренных показателей АД и ЭКГ в виде нижней и верхней границ референтного интервала представлены в таблицах отдельно для самцов и самок каждой из использованных пород, а также по диапазонам массы тела вне зависимости от породы.

Статистический анализ референтных интервалов был выполнен с помощью лицензированного программного обеспечения Microsoft Excel, а также бесплатного программного обеспечения Reference Value Advisor v2.1 (National Veterinary School, г. Тулуза, Франция), соответствующего руководству CLSI²⁸, при использовании робастного метода расчета. Для выявления отличий при сравнении данных от разных полов, пород и диапазонов масс тела при помощи парного Т-теста использовали лицензированное программное обеспечение Statistica 10.0 (StatSoft, США).

В настоящее время одобренное руководство CLSI по определению, установлению и проверке референтных интервалов в клинической лаборатории рекомендует непараметрический метод определения интервалов для размеров выборки не менее 120 значений и робастный метод для размеров выборки в пределах 40–120 значений²⁹. Согласно литературным данным параметрический подход также является одним из наиболее часто используемых подходов, однако этот метод игнорируется руководством CLSI, несмотря на его потенциальную возможность продемонстрировать наилучшую производительность для данных с нормальным распределением [17]. Параметрический метод считается нестабильным при анализе менее 150 значений [18] и используется в литературе при наличии более 200 значений.

При расчете референтных интервалов параметров ЭКГ и показателей АД в зависимости от количества животных проводили робастным методом (количество значений менее 120), при этом соответствие закону нормального распределения определяли по Андерсону–Дарлингу и в случае ненормального распределения использовали преобразование Бокса–Кокса, или непараметрическим методом (количество значений более 120).

Также, согласно руководству CLSI²⁹, из массива данных необходимо исключить статистические выбросы, лежащие за пределами интервала (Q1–1,5×IQR) — (Q3+1,5×IQR), где Q1 и Q3 — границы 1-го и 3-го квартилей; IQR — межквартильный интервал [17][19]. Долю обнаруженных выбросов определяли по методу Тьюки.

Результаты исследования. Для электрокардиограммы кролика характерны специфические особенности, которые следует учитывать при оценке сердечной функции, например степень выраженности зубцов [20]. В связи с этим при проведении анализа фиксировали нехарактерные для человека особенности ЭКГ кроликов, представленные в таблице 1, в которой отображено процентное количество изменений относительно всех исследованных животных (597 электрокардиограмм — 308 самцов и 289 самок).

Следует отметить, что при анализе встречались записи ЭКГ, где в связи с помехами практически не отслеживалась изоэлектрическая линия, которая могла быть представлена в виде повторяющихся положительных и отрицательных зубцов («волн»), что сделало измерение амплитуды зубцов невозможным, а измерение продолжительности интервалов затрудненным.

Также у самцов и самок наблюдали случаи, при которых амплитуда зубцов Q и S имела сильную зависимость от отведения — зубец мог практически отсутствовать в одном отведении и превышать значения амплитуды зубца R в другом (в отрицательные значения). У самцов данное явление отмечали в 3 % записей ЭКГ с зубцом S и в 5,5 % — с зубцом Q; у самок — в 1,4 % записей ЭКГ с зубцом S и 1,7 % — с зубцом Q. Ввиду отсутствия зубца Q на записи ЭКГ, интервал PQ общепринято заменять на интервал PR [21][22].

Амплитуда зубцов QRS в отведениях зависит от проекции электрической оси сердца, данное измерение не проводили у кроликов ввиду особенностей анатомии сердца и изображения ЭКГ, сложности интерпретации, а также отсутствия литературных данных о корректном для данного анализа положении тела. Однако при анализе проводили измерение амплитуды зубца R и отмечали соотношение высоты зубца R в каждом из трех отведений. В 54 % записей у самцов и в 51 % записей у самок зубец R имел самую высокую амплитуду в отведении I и равнозначную отрицательную амплитуду в отведении III, соответственно, во II отведении амплитуда была практически аналогичной отведению I или ниже, но положительной. В 22 % случаев у самцов и 26 % случаев у самок амплитуда зубца R в отведении II была выше, чем в отведениях I и III. В 14 % записей у самцов и 16 % у самок амплитуда зубца R в отведении III превышала таковую в отведении II, которая, в свою очередь, превышала амплитуду в отведении I. В остальных записях ЭКГ (9 % у самцов и 7 % у самок) ввиду сложностей корректной оценки амплитуды зубца R измерение не проводили.

Референтные интервалы по параметрам ЭКГ и показателям АД представлены отдельно для самцов и самок каждой породы кроликов в таблицах 2–4. Продолжительность интервалов ЭКГ вычислялась от подъема/депрессии относительно изоэлектрической линии зубца, указанного в интервале первым (например, зубец Q в интервале QT), до возвращения импульса на изоэлектрическую линию (в том числе в случае ее депрессии) после зубца, указанного последним в интервале (например, зубец Т в интервале QT), или на вершине зубца J, если таковой наблюдался. Как наблюдалось ранее, наибольшее количество особенностей и процент их встречаемости отмечали у зубцов Р и S, а также у зубца Q (таблица 1), в связи с чем измерение амплитуд данных зубцов не проводили во избежание представления некорректных данных. Измерение амплитуды зубца R проводили относительно участка электрической линии, расположенной перед комплексом QRS (зубцом Q), амплитуды зубца Т — относительно участка, записанного непосредственно после измеряемого зубца Т.

При рассмотрении рассчитанных референтных значений по трем породам кроликов можно обнаружить отсутствие существенных различий между породами по ЧСС, продолжительности интервалов и показателям АД.

Одним из важных критериев, потенциально влияющих на параметры ЭКГ, наряду с породой, возрастом и полом [23], является размер животных [24], который зависит, в частности, от породы и возраста, в связи с чем было принято решение провести сравнение и расчет референтных интервалов по диапазонам масс самцов и самок кроликов вне зависимости от породы. Также подобный расчет потенциально может быть применен к другим породам кроликов в соответствующем диапазоне масс. При сравнении показателей ЭКГ при помощи парного Т-теста различия были выявлены для большей части измеряемых интервалов ЭКГ между животными массой до 3,5 кг и более 3,5 кг.

Референтные интервалы параметров ЭКГ, рассчитанные отдельно для самцов и самок каждого диапазона веса, представлены в таблице 5.

При сравнении с литературными данными по ЧСС отмечено, что они входят в интервал полученных референтных интервалов для соответствующей породы (216±18 уд/мин, M±SD [15]) или массы (264±33,9 уд/мин, M±SD [21], 261±13 уд/мин, M±SD [22], 260±1,8, M±SD [24]). Также в рассчитанный интервал вошли все значения, представленные в статье, в которой результат измерения ЧСС каждого из 90 кроликов выражался в виде процента относительно выборки [25]. При этом сравнение с данными исследования, проведенного на неполовозрелых кроликах (2–2,5 месяца), показало, что их ЧСС находится выше референтных интервалов (240–300 уд/мин) [20].

Один из источников приводит расчет средних значений и референтных интервалов по выборке 46 здоровых домашних кроликов разного пола. Средние значения показателей ЭКГ, в том числе амплитуды зубцов R и Т, соответствуют интервалам по диапазонам масс тела, однако референтные интервалы, приведенные в источнике, только частично сопоставимы с интервалами, рассчитанными в настоящей статье: нижняя граница практически всех показателей выходила за пределы референтных значений (данной статьи) [21]. Отличия интервалов могут быть связаны с относительно небольшой выборкой (46) в источнике, на это указывает то, что минимальные и максимальные значения ЭКГ животных, приведенные в статье, практически совпадают с рассчитанными ими референтными интервалами. При этом при сравнении параметров ЭКГ с литературным источником, приводящим их сводку по нескольким статьям [24], можно отметить, что интервалы P (0,03–0,04 с), PQ (0,057 с; 0,070 с) и QT (0,132 с; 0,140 с; 0,150 с) совпадают с референтными интервалами, интервал QRS либо находится на нижней границе интервала (0,040 с), либо выходит за нее (0,031 с). Высота зубца R в отведении II также входит с референтные интервалы (0,07–0,25 мВ и 0,10–0,15 мВ). Продолжительность P (0,03–0,04 с), PQ (0,07–0,08 с), QT (0,13–0,15 с), полученных у неполовозрелых кроликов, также входят в рассчитанные диапазоны, в то же время, значения интервала QRS находятся на нижней границе референтов (0,03–0,04 с) [20]. В работе, в которой представлена ЭКГ новозеландского кролика, снятая непрерывно в течение суток, большинство значений ЧСС и продолжительности QT находятся в пределах референтных интервалов, представленные значения интервала QRS были вблизи нижней границы референтных интервалов [26]. В другом исследовании значения интервалов QRS и QT находятся значительно выше полученных в данной работе результатов для новозеландских кроликов, в то время как амплитуда зубцов R и T попадает в пределы рассчитанных референтных значений, наряду со значениями артериального давления [27].

В исследовании на домашних кроликах интервал QRS находится в пределах рассчитанных референтных интервалов, при этом значения ЧСС были значительно ниже, а значения интервала QT, пропорционально, значительно выше полученных в данной работе результатов для соответствующего веса [28]. Данные особенности могут быть связаны как с особенностями домашних кроликов, так и с применяемыми препаратами для наркотизации.

При сравнении полученных интервалов САД и ДАД с представленными в литературе значениями отмечено, что при измерении данных показателей у животных в сознании значения значительно выше [29], чем у животных в состоянии наркотизации и, соответственно, выше рассчитанных интервалов, что, вероятно, связано с психическим состоянием животного в момент проведения манипуляции измерения. Все средние значения, указанные в источнике, приводящем обобщенную информацию по многим статьям, входят в границы референтных интервалов [24]. В другом источнике, где представлено количество животных с определенными значениями САД [25], наблюдается, что 92 % кроликов попадают в референтные интервалы, остальные значения находятся незначительно выше.

Доля обнаруженных выбросов по исследуемым показателям для каждого пола и породы относительно массива данных представлена в таблицах 6–8. В таблице 9 представлена доля выбросов отдельно для самцов и самок каждого диапазона веса.

Наибольшее количество выбросов отмечено у самцов породы новозеландская по интервалу QT (10,5 %), при этом выбросы по остальным параметрам ЭКГ и показателям АД у данной и других пород не превышают 4,1 % у самок и 3,1 % у самцов.

Наибольшие выбросы отмечены у самцов массой 3,5–5,8 кг по интервалам QRS (4,9 %) и QT (6,9 %). У самцов массой 2,0–3,5 кг выбросы не превышали 4,4 %, у самок массой 2,0–3,5 кг — 3,0 %, у самок массой 3,5–5,8 кг — 3,5 %.

Обсуждение и заключение. Описанные особенности ЭКГ кроликов могут оказать значительное влияние на интерпретацию данных и скорректировать получаемые результаты. В частности, отсутствие зубца Q в комплексе QRS отмечается в литературных источниках. Однако более подробное описание специфического изображения ЭКГ у кроликов в литературе практически не представлено, за исключением непосредственно изображений записи ЭКГ.

Диапазоны значений референтных интервалов параметров ЭКГ и показателей АД практически не различаются при анализе у разных пород и кроликов разных масс и пола. Тем не менее данные были представлены в зависимости от пола, породы и массы кроликов для оптимизации процесса анализа результатов.

Установленные референтные интервалы параметров ЭКГ совпадают с частью значений, представленных в литературных источниках, наиболее вариабельными являются интервал QRS и амплитуды зубцов R и T, что может быть связано с качеством записи и интерпретацией результатов определенным исследователем. Результаты измерения ЧСС, САД и ДАД преимущественно совпадают с данными, найденными в литературе, за исключением источника, в котором измерение показателей АД проводили на животных в сознании, что значительно повысило диапазон значений.

Полученные референтные интервалы и описанные особенности электрокардиограммы кроликов могут быть использованы при анализе и интерпретации данных, полученных в доклинических исследованиях.