Оценка изменений плотности тканей почек у крыс с гиперлипидемией методом микро-КТ

Введение. Компьютерная рентгеновская микротомография (микро-КТ) — это метод, позволяющий получать трёхмерные изображения микроскопических внутренних и внешних структур образцов без их разрушения, что делает возможным исследование объектов, не доступных другим способам анализа [1]. Основой метода является получение набора рентгеновских проекционных изображений при вращении образца, размещённого между рентгеновским источником и детектором (хотя возможны и другие схемы размещения образца [2]). Далее с помощью специализированных алгоритмов реконструкции эти изображения преобразуются в серии поперечных сечений [3].

Микро-КТ отличается от традиционной КТ и прицельной рентгенографии по ряду параметров, включая разрешение, область применения и дозу облучения [3]. Микро-КТ обеспечивает сверхвысокое разрешение (до 1 мкм) и позволяет получать детализированные трёхмерные изображения, что делает её незаменимой в научных исследованиях, изучении тканей ex vivo и экспериментальной онкологии [3]. Однако использование метода ограничено длительным временем сканирования и высокой лучевой нагрузкой, что снижает его применимость in vivo. Традиционная КТ широко используется в клинической практике для диагностики патологий внутренних органов и костной системы. Она позволяет быстро получать 3D-изображения с разрешением порядка 0,5-1 мм, а также использовать контрастные вещества для улучшенной визуализации мягких тканей [4-5]. Прицельная рентгенография применяется преимущественно в стоматологии (bitewing X-ray — рентгеновский снимок укуса) для выявления кариеса, оценки состояния костной ткани и пародонта. Это быстрый и малодозовый метод, но он даёт только двухмерное изображение и не подходит для детального изучения сложных структур [4].

Выбор метода визуализации зависит от конкретной задачи. Если необходимо максимально детализированное изображение тканей, предпочтение отдаётся микро-КТ, но для клинической диагностики и работы с живыми пациентами более подходят традиционная КТ и прицельная рентгенография. Более подробно характеристики методов описаны в Таблице 1.

Основные преимущества микротомографии:

– высокое разрешение: технология позволяет получать изображения с минимально различимой деталью менее одного мкм до десятков мкм, обеспечивая четкость, детализацию [5][6] и, при необходимости, исследование достаточно крупных образцов [6];

– широкий спектр применения благодаря возможности получения 2D- и 3D-изображений: 2D-изображения применяются для измерения длины, толщины и углов искривления, а 3D-формат помогает выявлять патологические изменения, такие как остеолиз или гиперплазия костей [4], онкологические образования [3], деминерализация тканей зуба [4] и др.;

– цифровая обработка данных: изображения легко поддаются цифровой обработке и рендерингу [7], что позволяет вращать и анализировать их в трех измерениях для более глубокого понимания состояния объекта [8].

Высококачественные изображения, полученные с использованием микро-КТ, позволяют исследователям детально визуализировать патологические процессы на экспериментальных моделях животных, что способствует более точной диагностике заболеваний, оценке эффективности терапевтических стратегий и лучшему пониманию механизмов их развития. Также возможность детального изучения патологических изменений, таких как жировая инфильтрация тканей при гиперлипидемии, способствует расширению научных знаний и совершенствованию методов лечения [5, 6].

За последние десятилетия микро-КТ стала мощным инструментом в биомедицинских исследованиях, широко применяемым при изучении морфологии костей [3], фенотипировании животных [1], а также в исследовании патологий внутренних органов [5]. Оптимизация разработки и введения контрастных веществ позволила значительно расширить возможности метода. Визуализация in vivo обеспечивает оценку морфологии сосудов и мягких тканей, однако ex vivo исследование даёт более высокое разрешение за счёт увеличенного времени сканирования и отсутствия ограничений, связанных с анестезией и облучением [9].

В неврологии микро-КТ используется для анализа сосудистой анатомии головного мозга, выявления атеросклеротических поражений и оценки нарушений гематоэнцефалического барьера [9]. Кроме того, методика позволяет проводить продольные исследования роста опухолей мозга и эффективности противоопухолевой терапии.

В кардиологии микро-КТ с контрастным усилением применяется для визуализации системы проведения сердечного импульса, диагностики врождённых пороков сердца и количественной оценки лёгочной вентиляции при фиброзе лёгких [10].

Микро-КТ также активно используется в онкологических исследованиях. Например, в моделях колоректального рака метод демонстрирует высокую корреляцию между объёмом опухоли и гистологическими данными [9]. Применение контрастных веществ позволяет дифференцировать здоровые ткани печени от неоплазий, что даёт возможность количественно оценивать метастазы и эффективность экспериментальной терапии [9].

Исследования костной ткани с помощью микро-КТ охватывают широкий спектр патологий, включая остеопороз, заживление переломов, остеогенез и резорбцию костей при опухолевых процессах [2]. Методика также используется для оценки взаимодействия мягких тканей с имплантатами, изучения ангиогенеза и мышечной дистрофии [9].

В ветеринарной медицине микро-КТ становится все более востребованной благодаря возможности получать высококачественные трёхмерные изображения тканей и структур, а также способности неразрушающим методом исследовать анатомические особенности и патологические изменения с пространственным разрешением до 1 мкм [10]: возможность визуализации без необходимости разрезания биопсийного материала особенно ценно для последующего гистологического анализа [11].

Микро-КТ может применяться как in vivo, так и ex vivo: в режиме in vivo метод позволяет визуализировать изменения тканей у мелких животных с разрешением до 30 мкм, при минимальной дозе облучения [11–13]. Однако его применение ограничено низкой чувствительностью к мягким тканям, что компенсируется использованием контрастных веществ. В режиме ex vivo микро-КТ достигает ещё более высокого разрешения благодаря длительным экспозициям, позволяя получать детализированные изображения, превосходящие результаты гистологического анализа.

Благодаря возможностям 3D-реконструкции и цифровой обработки данных, микро-КТ обеспечивает исследователям уникальную возможность анализировать морфологию тканей, разрабатывать виртуальные модели и даже создавать точные физические 3D-прототипы [14][15]. В дополнение к этому, интеграция микро-КТ с традиционными методами диагностики, такими как гистопатология, расширяет её диагностический потенциал, позволяя комбинировать точные количественные данные с визуальной оценкой структуры тканей [13]. Благодаря методам in silico для микро-КТ стало возможным проводить 3D-реконструкцию, сегментацию, морфометрический анализ и вычисление плотности тканей без разрушения образцов [16].

Несмотря на активное развитие современных методов визуализации, возможности применения микро-КТ для комплексного анализа состояния мягких тканей и внутренних органов животных пока недостаточно изучены. Потенциал метода для детальной количественной оценки морфологических изменений внутренних органов, связанных с патологическими процессами, остается относительно новым направлением. В частности, практически отсутствуют работы, посвященные комплексному анализу плотности и трехмерной морфологии почечной ткани у животных экспериментальных моделей с алиментарно индуцированными патологиями, такими как гиперлипидемия. Выбор почек в качестве объекта исследования обусловлен их ключевой ролью в метаболизме и высокой уязвимостью при системных нарушениях, к которым относится и гиперлипидемия. Развивающиеся при этом структурные изменения (жировая инфильтрация, фиброз) напрямую влияют на плотность тканей почек, что делает микро-КТ идеальным методом для их детекции и количественной оценки.

Цель работы — оценить эффективность применения микро-КТ для изучения патологических изменений плотности и морфологии тканей почек у лабораторных крыс с разной степенью гиперлипидемии.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на базе Донского государственного технического университета (г. Ростов-на-Дону) в период с 2021 по 2024 гг. 40 самцов крыс линии Wistar были разделены на 5 групп (4 опытные и 1 контрольная), по 8 животных в каждой. Животные содержались в виварии ДГТУ на древесной подстилке, которая менялась каждую неделю.

Все животные в течение первых 30 суток получали стандартный рацион. После этого 1-я группа была выведена из эксперимента путем декапитации; 2-я, 3-я и 4-я группы были переведены на гиперлипидемическую диету с повышенным содержанием холестерина; 5-я (контрольная) группа в течение всего периода получала только стандартный корм. На 120-е, 150-е и 180-е сутки животные 2-й, 3-й и 4-й групп соответственно были эвтаназированы методом декапитации; 5-я группа выведена из эксперимента одновременно с 4-й на 180-е сутки. После этого было проведено вскрытие для забора почек и пробоподготовка материала для микро-КТ с последующим анализом данных.

После первоначальной фиксации в 10-процентном формалине в течение 48 ч все образцы почек крыс были последовательно обезвожены в 50-, 70-, 80-, 90-, 96- и 100-процентном этаноле (выдержаны по 1 ч в каждом растворе). Затем образцы окрашивали 1-процентным раствором йода I₂ в абсолютном этаноле в течение 14 ч. Наконец, образцы промывали в абсолютном этаноле и помещали в пластиковые контейнеры, заполненные абсолютным этанолом, для хранения при температуре +5 °C.

Сканирование проводилось на микротомографе Xradia Versa 520 (Carl Zeiss X-ray Microscopy, США). Образцы фиксировались вертикально в пластиковых пробирках, заполненных абсолютным спиртом, и устанавливались в цанговый держатель, расположенный вне поля зрения детектора. Исследования выполнялись в обычном воздушном пространстве камеры прибора, без применения дополнительных сред.

Для получения качественных данных сканировались три сегмента каждого образца, начиная с нижнего и заканчивая верхним. Общие параметры сканирования:

– увеличение объектива: 0,4×;

– напряжение источника: 80 кВ;

– мощность: 6,5 Вт;

– размер вокселя: 20 мкм;

– вращение: 360°;

– время экспозиции: 1 с;

– количество проекций: 1601 для каждого сегмента.

Сбор проекционных данных завершался реконструкцией микротомограмм с использованием программного обеспечения (Carl Zeiss AG, Германия). Для повышения чёткости контуров вручную настраивались параметры смещения центра. Итоговая обработка реконструированных данных проводилась в программе VGStudio MAX 3.5 (Volume Graphics GmbH, Германия):

– удаление среды вокруг образца выполнялось вручную с использованием гистограммы плотности;

– для визуализации использовался объёмный рендерер по Фонгу [17];

– сегментация структур проводилась с применением ручных, автоматических и полуавтоматических инструментов. Каждая область интереса помечалась псевдоцветом.

Эффективность микро-КТ оценивалась по качеству визуализации и реконструкции, т. е. по способности метода чётко выделять корковое и мозговое вещество, сосуды и другие структуры почек в трёхмерной модели с высокой детализацией и минимальными артефактами. Также учитывался количественный анализ
изменений тканей — измерение плотности через значения серого (MGV, mean gray value).

Результаты исследования. На высококачественных микротомограммах почек удалось чётко выделить структурные компоненты органа: корковое вещество и почечную артерию (рис. 1); мозговое вещество (рис. 2); сосудистую сеть, включая крупные артериальные и венозные сосуды, а также мелкие капилляры (рис. 3). На реконструированных 3D-моделях почек корковое вещество, мозговое вещество и сосуды выделены как ROI на основе средних значений серого (MGV). Для наглядной визуализации изменений плотности использовалась однородная по восприятию цветовая схема «плазма».

Наличие нескольких опытных групп позволило проследить временную динамику нарастания патологических изменений (в частности, увеличение плотности тканей) в ответ на длительность гиперлипидемического воздействия. Показатели плотности через средние значения серого (MGV) для каждой группы представлены в Таблице 2.

Данные таблицы демонстрируют четкую динамику изменения плотности тканей почек в зависимости от длительности гиперлипидемической диеты. Наиболее значительное увеличение плотности во всех структурах наблюдается во 2-й группе (3 месяца диеты), что, вероятно, отражает пик жировой инфильтрации и развития воспалительной реакции. К 5-му месяцу диеты (4-я группа) значения плотности приближаются к контрольным, что может свидетельствовать о развитии фиброза и склерозирования тканей, при которых плотность также повышается, но уже по иному механизму, требующему дальнейшего гистологического подтверждения.

Анализ сосудистой сети показал уплотнение стенок сосудов и потерю их эластичности, что свидетельствует о снижении кровоснабжения и повышенном риске ишемических повреждений ткани. Полученные данные согласуются с предыдущими исследованиями фиброза кавернозных тел на модели кастрированных кроликов, где микро-КТ позволила количественно оценить изменения радиоплотности на различных стадиях заболевания [18].

Обсуждение и заключение. В ходе проведённого микро-КТ-исследования были получены изображения почек с высоким разрешением, что позволило детально визуализировать их структуру. Метод продемонстрировал высокую точность в определении плотностных характеристик почечных тканей при гиперлипидемии, что может быть полезно для оценки структурных изменений при различных патологиях. Анализ плотности позволяет проводить количественную оценку таких изменений и связывать их с клиническими проявлениями заболевания.

Ограничения исследования включают небольшой размер выборки, использование только одной линии крыс (самцы Wistar), что ограничивает генерализацию результатов, а также возможное влияние сроков эксперимента и диеты на развитие патологий и вариабельность данных. Подготовка образцов (фиксация, обезвоживание, окрашивание) могла вызвать артефакты, влияющие на точность измерений плотности тканей. Также следует учитывать ограничения самого метода микро-КТ — высокую стоимость оборудования и расходных материалов, низкую чувствительность к мягким тканям без контрастных веществ, ограничения при in vivo исследованиях (анестезия, дозы облучения, время сканирования), необходимость специального программного обеспечения и навыков для обработки и анализа данных.

Дальнейшие исследования могут быть направлены на применение контрастных агентов, позволяющих более детально изучить сосудистую сеть почек и процессы, связанные с их перфузией. Также необходимо установить эффективность микро-КТ для выявления и количественной оценки нарушений структуры и фиброза путём прямого сопоставления с гистопатологией. Такой подход позволит более точно определять изменения на клеточном и тканевом уровнях и расширит возможности применения микро-КТ в клинической практике для диагностики и мониторинга заболеваний.