H₂S-зависимые механизмы экспрессии и локализации каспазы-3 в клетках головного мозга мышей при черепно-мозговой травме

Введение

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является одной из самых распространенных причин смерти и инвалидности среди животных. ЧМТ приводит к сложному каскаду патофизиологических процессов, включая первичное механическое повреждение ткани мозга и последующее вторичное повреждение, обусловленное воспалением, окислительным стрессом, эксайтотоксичностью и апоптозом. Вторичное повреждение, развивающееся после травмы, играет ключевую роль в прогрессировании тяжести состояния, привлекая значительное внимание ученых всего мира, стремящихся найти эффективные стратегии лечения и нейропротекторные препараты [1–3].

В последние годы растет интерес к роли газотрансмиттеров, таких как сероводород (H₂S), в патофизиологии ЧМТ. H₂S, долгое время считавшийся исключительно токсичным газом, в настоящее время признан важной биологически активной молекулой, способной участвовать в ряде физиологических и патологических процессов, включая нейромодуляцию, сосудистую регуляцию, противовоспалительное действие и антиоксидантную защиту. В центральной нервной системе H₂S действует как нейромодулятор и нейропротектор, влияя на различные сигнальные пути, включая связанные с клеточной гибелью по типу апоптоза [4][5].

Одним из ключевых проапоптотических белков является каспаза-3 — эффекторная цистеин-содержащая протеаза, расщепляющая белки исключительно после аспартата и занимающая центральную позицию в реализации апоптоза. Было показано, что каспаза-3 может являться потенциальной мишенью для H₂S и его активных производных. Однако сведения о роли H₂S-зависимых механизмов в регулировании каспазы-3 носят противоречивый характер. В одних исследованиях было показано, что H₂S может уменьшать экспрессию данного фермента [6–8], а в других научных работах демонстрируется H₂S-зависимая экспрессия каспазы-3 и цитотоксический эффект [9–11]. Таким образом, механизмы, посредством которых H₂S влияет на экспрессию и локализацию каспазы-3 при ЧМТ, остаются малоизученными [9].

Целью настоящего исследования является изучение H₂S-зависимых механизмов регуляции каспазы-3 при ЧМТ. Мы предполагаем, что H₂S может оказывать модулирующее влияние на экспрессию и локализацию каспазы-3, тем самым воздействуя на интенсивность и продолжительность нейровоспалительного ответа при ЧМТ. Изучение этих механизмов позволит лучше понять сложный патогенез ЧМТ и открыть новые перспективы для разработки терапевтических стратегий, направленных на модуляцию нейровоспаления и улучшение восстановительных процессов в мозге.

Материалы и методы

Этическое одобрение

Все исследования были одобрены этическим комитетом ДГТУ, также они соответствовали международным требованиям по биоэтике.

Объект и процедуры

Исследования проводились в лаборатории «МедЦифра» факультета «Биоинженерия и ветеринарная медицина» кафедры «Биоинженерия» ДГТУ в период c 20 апреля по 1 июня 2024 г. В общей сложности в эксперимент было включено 36 взрослых самцов мышей CD-1, возраст которых составлял от 14 до 15 недель, а масса тела — 20–25 г. Мыши содержались в стандартных условиях вивария: в пластиковых клетках с подстилкой из опилок, при температуре 22 ± 2 °C, относительной влажности 50–60 % и 12-часовом свето-темновом режиме. Кормление осуществлялось стандартным гранулированным кормом для лабораторных грызунов, доступ к воде был свободным.

Мыши были разделены на три группы: контрольную, которой вводили физиологический раствор, и две экспериментальные, которым вводили инъекции донора Н₂S сульфида натрия (Na₂S, 0,1 мг/кг; Khimikon, Россия), либо ингибитора цистатионин-β-синтазы (CBS) аминооксиуксусную кислоту (AOAA, 5,0 мг/кг; Tianjin Xidian Chemical Technology Co., Ltd., Китай), соответственно. Использование Na₂S и AOAA позволяло эффективно модулировать уровень эндогенного Н₂S в головном мозге: Na₂S способен эффективно высвобождать H₂S; а AOAA — ингибитор CBS, фермента, ответственного за эндогенный синтез H₂S. Препараты вводились внутрибрюшинно после травмы в течение 7 дней ежедневно до выведения животных из эксперимента.

Для всех групп применялась одна модифицированная версия стандартного протокола для моделирования ЧМТ. Мыши получали анестезию путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (300 мг/кг). Затем сбрасывался груз с высоты 3 см на необнаженный череп. Координаты сброса груза задавались как 2 мм дорсально от брегмы, 1 мм латерально от срединной линии. Удар осуществлялся устройством для сброса груза, которое представляло собой металлический стержень (с наконечником диаметром 3 мм, длиной 5 мм) весом 200 г. После пробуждения от наркоза мыши возвращались в свое обычное жилище [12].

Иммунофлуоресцентный анализ

Для идентификации локализации каспазы-3 через 7 дней после ЧМТ использовался следующий протокол. Извлекалась область вокруг очага некроза, вызванного ударом груза, а также из левого, неповрежденного полушария. Вырезанный кусочек коры головного мозга мыши фиксировали в 4 % PFA в течение 12 часов при температуре +4 °С с постоянным помешиванием. Далее с помощью автоматического микротома с вибрирующим лезвием Leica VT1000 S (Leica Biosystems Nussloch, Германия) были получены срезы толщиной 20 мкм. Для блокирования сайтов неспецифичного связывания срезы инкубировали 60 мин при температуре +24 °С в растворе, содержащем 5 % BSA и 0,3 % тритоном X-100.

Затем срезы инкубировали с первичными антителами аnti-CASP3 (1:100, Rabbit, AF6311, Affinity, Китай, антитело против каспазы-3) и anti-NeuN (1:1000, Mouse, FNab10266, Fine Test, Китай, антитело против ядерного белка NeuN) в течение 48 часов при температуре +4 °C. После многократной промывки в PBS срезы инкубировали с вторичными антителами anti-Rabbit IgG (H+L) Fluor 488-conjugated (1:500; S0018, Affinity Biosciences, Китай) и anti-Mouse IgG (H+L) Fluor 594-conjugated (1:500; S0005, Affinity Biosciences, Китай). Затем срезы заключали в глицерин, получая препараты для анализа на флуоресцентном микроскопе Альтами ЛЮМ 1 (Ningbo Haishu Honyu Opto-Electro Co., LTD, Китай совместно с компанией «Альтами», Россия), оснащенном цифровой камерой высокого разрешения EXCCD01400KPA (Hangzhou Toup Tek Photonics Co., Ltd., Китай).

Анализ колокализации каспазы-3 с NeuN осуществлялся с использованием специального пакетного обеспечения Image J, дополненным плагином JACoP [13]. Оценку среднего уровня флуоресценции каспазы-3 проводили на 10 фотографиях срезов для каждой мыши, опыта и контроля, по следующей формуле:

где I_mean — средняя интенсивность в исследуемой области; I_back — средняя интенсивность фона.

Иммуноблоттинг

Исследование экспрессии каспазы-3 в условиях активации или ингибирования сигнального пути H₂S в области пенумбры коры головного мозга мышей после ЧМТ было проведено методом вестерн-блота. Через 7 дней после травмы животные были декапитированы, извлечен мозг, и на льду с помощью цилиндрического ножа была удалена область инфаркта. Далее другим ножом было вырезано кольцо шириной 2 мм, соответствующее пенумбре. Эти кольца сравнивались с контрольными образцами из коры другой стороны мозга той же мыши. Образцы подвергали гомогенизированию в буфере для лизиса тканей, который был дополнен ингибиторами протеаз и фосфатаз. Далее полученный гомогенат центрифугировали для получения надосадочной жидкости. В супернатанте определяли концентрацию белка, используя метод Бредфорда. Затем в лунки в полиакриламидном геле вносили 25 мкг белка в 20 мкл и подвергали электрофорезу в присутствии додецилсульфата натрия. В качестве оборудования использовалась Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad, США). После электрофореза белки переносились на нитроцеллюлозную мембрану методом полусухого переноса с помощью Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, США). Затем использовались первичные антитела против каспазы-3 (1:100, AF6311, Affinity, Китай) и β-актина и вторичное антитело кролика к иммуноглобулину IgG, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (1:1000; S0001, Affinity Biosciences, Китай). Затем проводили хемилюминесцентную детекцию белков. Для обнаружения хемилюминисценции использовали систему гель-документирования SH-Advance523 (Shenhua Science Technology Co., Ltd., Китай).

Статистический анализ

Для статистической обработки и анализа полученных результатов использовали метод однофакторного дисперсионного анализа. Парное множественное сравнение проводили с помощью критерия Тьюки. Параметрические критерии использовались при соблюдении правил нормальности и однородности дисперсий, которые оценивали с помощью теста Шапиро-Уилка и Брауна-Форсайта, соответственно. Если гипотеза о нормальности и гомогенности дисперсий не подтверждалась, использовался непараметрический критерий Краскела-Уоллиса. Статистически значимая достоверность считалась при р<0.05. Для статистического анализа использовался программный пакет SigmaPlot версии 12.5 (Systat Software, Inc., США).

Результаты

В результате иммунофлуоресцентной микроскопии было продемонстрировано, что каспаза-3 имеет локализацию в нервных и глиальных клетках. Их нуклеоплазма была визуализирована с помощью флуорохрома Hoechst 33342. Также колокализационный анализ показал, что каспаза-3 совместно обнаруживается с NeuN, ядерным белком нейронов, и GFAP, маркером астроцитов (рис. 1 a).

При этом экспрессия каспазы-3 в нейронах ипсилатеральной и контралатеральной коры мозга мышей контрольной и экспериментальных групп значительно отличается. Это подтверждают результаты коэффициента М1, отражающего степень колокализации NeuN c целевым белком, а именно с каспазой-3. В контралатеральной коре уровень каспазы-3 был незначительным во всех группах на протяжении всех временных интервалов после моделирования ЧМТ. Однако травматическое воздействие приводило к быстрому росту экспрессии каспазы-3 в нейронах поврежденной зоны мозга относительно контралатеральной области в 2,2 раза через 7 дней после ЧМТ (p<0.01). Использование Na₂S приводило к снижению уровня каспазы-3 на 32 % в ипсилатеральной коре относительно ипсилатерального полушария контрольной группы (p<0.05) (рис. 1 b).

Применение ингибитора CBS оказывало обратный эффект. Так через 7 суток после травмы значение коэффициента M1 каспазы-3 в поврежденных нейронах мозга животных, которым делали инъекцию AOAA, увеличился на 31 % (p<0.05) относительно поврежденных клеток контроля. Также экспрессия каспазы-3 увеличилась в 2,5 раза (p<0.01) в нервных клетках ипсилатерального полушария группы животных, которым делали инъекцию AOAA, относительно нейронов противоположного полушария этого же животного (рис. 1 b).

Анализ флуоресценции каспазы-3 в цитоплазме нейронов также показал, что уровень данного фермента увеличивается в поврежденных нервных клетках. Интенсивность флуоресценции в цитоплазме нейронов контрольной группы и экспериментальных животных, которым вводили Na₂S и AOAA, увеличивалась в 2,7 раза (p<0.01), на 56 % (p<0.01), и в 2,4 раза (p<0.01) относительно контралатеральной коры, соответственно. При этом уровень каспазы-3 уменьшался в ипсилатеральной коре животных, которым вводили Na₂S, и увеличивался в группе, которой вводили AOAA, относительно ипсилатеральной коры контроля на 26 % (p<0.05) и 21 % (p<0.05) через 7 дней после ЧМТ, соответственно (рис. 1 c).

Далее мы исследовали уровень каспазы-3 в астроцитах, которые идентифицировали с помощью специфического маркера GFAP. C помощью анализа колокализации нам удалось установить, что каспаза-3 экспрессируется в этом типе глиальных клеток после ЧМТ. Кроме этого, донор Na₂S и ингибитор AOAA оказывали противоположные эффекты на динамику экспрессии каспазы-3 в астроцитах после ЧМТ (рис. 1 d). Так было показано, что уровень данного фермента увеличивается в ипсилатеральной коре контрольной и экспериментальных групп, которым вводили Na₂S и AOAA, относительно контралатеральной коры в 2,2 раза (p<0.01), 65 % (p<0.01), и в 3 раза (p<0.01), соответственно. Также уровень каспазы-3 уменьшался в ипсилатеральной коре животных, которым вводили Na₂S, и увеличивался в группе, которой вводили AOAA, относительно ипсилатеральной коры контроля на 19 % (p<0.05) и 41 % (p<0.05) через 7 дней после ЧМТ, соответственно (рис. 1 c).

Данные флуоресцентной микроскопии подтверждают результаты, полученные в ходе вестерн-блот анализа общей фракции нервной ткани головного мозга контрольной и экспериментальных групп, которым вводили Na₂S и AOAA (рис. 2).

Было показано, что экспрессия каспазы-3 через 7 дней после ЧМТ увеличивается в ипсилатеральной коре мозга животных контрольной и экспериментальных групп, которым вводили Na₂S и AOAA, относительно контралатеральной коры в 2 раза (p<0.001), 36 % (p<0.05), и практически в 2,6 раза (p<0.001), соответственно. При этом экспрессия каспазы-3 в ипсилатеральной коре животных, которым вводили Na₂S и AOAA, относительно ипсилатеральной коры контроля уменьшалась на 24 % (p<0.05) и увеличивалась на 44 % (p<0.05), соответственно (рис. 2).

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что иммунофлуоресцентная микроскопия показала, что каспаза-3 колокализуется с маркерами нейрональных ядер NeuN и астроцитов GFAP в нейронах и глиальных клетках. В контрольной и экспериментальных группах наблюдались различия в экспрессии каспазы-3 между ипсилатеральной (поврежденной) и контралатеральной (неповрежденной) корой мозга. Травма приводила к значительному увеличению экспрессии каспазы-3 в нейронах и глиальных клетках поврежденной области через 7 дней после ЧМТ, что указывало на активацию апоптоза.

Использование донора Na₂S снижало уровень каспазы-3 в нейронах ипсилатеральной коры, а ингибитор AOAA вызывал противоположный эффект, увеличивая экспрессию каспазы-3. Аналогичные результаты были получены при изучении каспазы-3 в астроцитах, где наблюдалась повышенная экспрессия в группе с AOAA и пониженная в группе с Na₂S.

Вестерн-блот анализ общей фракции нервной ткани головного мозга контрольной и экспериментальных групп подтвердил результаты иммунофлуоресцентной микроскопии. Введение Na₂S снижало экспрессию каспазы-3 в поврежденной области, тогда как AOAA способствовало её увеличению. Эти данные свидетельствуют о важной роли H₂S в регуляции апоптоза в нейронах и глиальных клетках после ЧМТ.

Обсуждение

На сегодняшний день известно, что H₂S может выступать в качестве мощного регулятора процесса апоптоза при нейротравмах. H₂S-зависимые механизмы регулирования клеточной гибели исследовались на многих экспериментальных моделях с использованием разных доноров H₂S и ингибиторов ферментов, ответственных за синтез H₂S. Однако роль H₂S-зависимых сигнальных механизмов в регулировании экспрессии и локализации каспазы-3 в нейронах и глиальных клетках при ЧМТ недостаточно изучены.

В нашем исследовании было показано, что H₂S является важным звеном в контроле уровня каспазы-3 в клетках головного мозга в условиях индуцированной механической травмы, моделирующей ЧМТ. Интенсивность клеточной гибели при вторичном повреждении, вызванном ЧМТ, напрямую коррелирует с уровнем проапоптотических белков. Каспаза-3 является одним из ключевых белков апоптоза. Увеличение уровня данного протеолитического фермента свидетельствует об инициации процессов, ведущих к клеточной гибели. Примененные нами быстрый донор сероводорода Na₂S и классический ингибитор ключевого фермента синтеза H₂S в нервной ткани AOAA оказывали противоположные эффекты на экспрессию данного белка. Изначальный уровень каспазы-3 в неповрежденных нейронах и глиальных клетках головного мозга был низким. Однако через 7 дней после ЧМТ уровень каспазы-3 значительно увеличивался, особенно в нейронах, а также глиальных клетках. Использование Na₂S позволяло снизить экспрессию данного фермента. Обратный эффект наблюдался в условиях ингибирования CBS с помощью AOAA.

H₂S регулирует уровень каспазы-3 через различные молекулярные механизмы, многие из которых связаны с его способностью влиять на антиапоптотические и антиоксидантные системы клеток. Одним из ключевых путей является повышение экспрессии белков семейства Bcl-2 [14], которые препятствуют активации каспаз, включая каспазу-3 [15]. Bcl-2 взаимодействует с проапоптотическими белками, такими как Bax и Bak, и предотвращает высвобождение цитохрома c из митохондрий. Это важный этап в процессе апоптоза, так как Cyt c участвует в формировании апоптосомного комплекса с Apaf-1 [16], который активирует каспазы и инициирует клеточную гибель. H₂S, повышая уровень Bcl-2, стабилизирует митохондриальные мембраны и препятствует апоптозу.

Кроме того, H₂S действует как мощный антиоксидант, эффективно снижая уровень активных форм кислорода (АФК), которые играют важную роль в индукции апоптоза через активацию каспаз [4][5][17][18]. Повышение уровня АФК вызывает повреждение митохондрий, что ведет к активации каспаз и последующей гибели клеток. Однако H₂S, обладая восстановительными свойствами, может напрямую нейтрализовать АФК, снижая их окислительный потенциал. Это уменьшает стресс на клеточные структуры, в том числе на митохондрии, и препятствует запуску каскада апоптоза. Более того, H₂S может активировать ряд антиоксидантных ферментов, таких как супероксиддисмутазы и каталазы, защищая клетки от избыточного уровня АФК [4][19].

H₂S также способен напрямую взаимодействовать с ферментом каспазой-3. Важно отметить, что в составе каспазы-3 содержится критически важный остаток цистеина, который может быть мишенью для модификации через персульфидирование — процесс, при котором H₂S присоединяет серу к тиоловой группе цистеина. Персульфидирование остатка цистеина 163 в активном центре каспазы-3 приводит к ингибированию её протеолитической активности, что предотвращает расщепление субстратов каспазы-3 и, соответственно, замедляет или останавливает апоптоз [20]. Это показывает, что H₂S может оказывать двойное действие на апоптоз: как опосредованно — через регуляцию антиапоптотических и антиоксидантных путей, — так и напрямую, ингибируя активацию каспаз.

Дополнительно H₂S может модулировать другие сигнальные пути, связанные с клеточной гибелью. Например, он может активировать сигнальный путь Nrf2 (ядерный фактор эритроидного 2-го типа), который является ключевым регулятором антиоксидантной защиты клеток. Nrf2 при активации запускает транскрипцию множества генов, отвечающих за антиоксидантную и цитопротекторную функции, тем самым снижая уровень оксидативного стресса и защищая клетки от апоптотического повреждения [21][22].

Также следует отметить, что H₂S может взаимодействовать с другими газотрансмиттерами, такими как оксид азота (NO) и угарный газ (CO), образуя комплексные сигнальные сети, которые регулируют клеточную выживаемость [23]. Синергетическое или антагонистическое взаимодействие H₂S с NO и CO может оказывать влияние на различные этапы апоптоза, включая активацию или ингибирование каспаз.

Таким образом, в нашем исследовании мы детально рассмотрели экспрессию и локализацию каспазы-3 в нейронах и астроцитах головного мозга при ЧМТ. Полученные в ходе исследования результаты носят как фундаментальное, так и практическое значение. Данные о роли H₂S в регуляции ключевого проапоптотического белка каспазы-3 расширяют представления о внутриклеточных сигнальных процессах выживания и гибели клеток нервной системы, а AOAA и Na₂S могут лечь в основу разработки клинически эффективных нейропротекторных препаратов.