Разработка методики получения биоэквивалента соединительной ткани кролика

Введение. В настоящее время в ветеринарии активно внедряются клеточные технологии, основанные на применении культур клеток и тканевых эквивалентов. Это обусловлено как необходимостью снижения этической нагрузки при экспериментальных исследованиях и совершенствованием экспериментальных моделей in vitro, так и развитием регенеративной медицины и внедрением в ветеринарию достижений в области медицины человека [1, 2]. Ориентиром в развитии данного научного направления является реализация биоэтических принципов 3R — Replacement, Reduction, Refinement (англ. Замена, Сокращение, Усовершенствование) [3], — направленных на оптимизацию использования животных в экспериментах, что стимулирует переход к in vitro моделям [4]. Клеточные культуры и тканевые эквиваленты, применяемые в качестве экспериментальных моделей, представляют собой практическую реализацию этих принципов, позволяя не только заменить и сократить число животных в исследованиях, но и повысить точность и воспроизводимость результатов за счет стандартизации [5].

Тканевой эквивалент (биоэквивалент) — это биоинженерный конструкт, представляющий собой аналог ткани или органа. Основными свойствами тканевого эквивалента являются клеточный состав, состав и свойства межклеточного вещества и определенная гистотипическая архитектура [6].

Соединительная ткань составляет около 50 % массы тела животных и выполняет важнейшие функции: опорную, репаративную, метаболическую; клетки в ее составе влияют на дифференцировку эпителиальных и мышечных клеток и ангиогенез. Соединительная ткань участвует в большинстве функций организма в норме, всегда вовлекается в патологический процесс и участвует в регенерации [7]. Вот почему разработка и внедрение в клиническую практику биоэквивалентов соединительной ткани, для временного или постоянного замещения дефектов и повреждений собственных тканей, высоко востребованы в регенеративной медицине.

C 2025 г. FDA (Food and Drug Administration — Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США) официально рекомендует использование in vitro платформ в токсикологических исследованиях и оценке эффективности новых фармакологических средств, отмечая, что клеточные модели, органоиды и тканевые эквиваленты более точно воспроизводят молекулярно-клеточные механизмы патогенеза, уменьшают межэкспериментальную вариабельность и повышают предсказательную способность получаемых данных [8, 9]. Интеграция in vitro систем на доклиническом этапе разработки лекарств позволяет снизить число отказов на более поздних стадиях клинических испытаний и оптимизировать риск-менеджмент при тестировании новых терапевтических стратегий [5, 9]. Современные исследования подтверждают, что применение клеточных культур дает воспроизводимые и статистически надежные данные при использовании меньших групп животных по сравнению с традиционными in vivo моделями, что сводит к минимуму биоэтические риски и повышает рациональность научных подходов [5]. Параллельно развивается направление модификации клеточных систем для создания высокоточных моделей специфических патологий, включая инфекционные, онкологические и метаболические, что дает возможность детального изучения молекулярных механизмов патогенеза и поиска новых мишеней для потенциальных лекарственных соединений [10, 11].

В ветеринарной регенеративной медицине активно внедряется использование мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) для терапии остеоартрита у лошадей и спинальных травм у собак и кошек [12]. Клиническая эффективность ММСК подтверждена исследованиями на собаках, где внутрисуставное введение аутологичных ММСК улучшало функцию суставов и снижало болевой синдром [13, 14]. Аналогичные результаты получены при лечении лошадей с повреждениями связочного аппарата [14–16]. Также терапия стволовыми клетками показала эффективность в лечении острых и хронических поражений кожи у собак [12].

Совершенствуется технология 3D-биопечати, позволяющая создавать многослойные тканевые конструкты из клеток и биосовместимых полимеров, близкие по архитектуре и механическим свойствам к собственным тканям. Применение бионапечатанных имплантатов при восстановлении костных дефектов у домашних животных улучшает остеоинтеграцию и ускоряет заживление [17]. 3D-бионапечатанные тканевые конструкты применяются в скрининге и исследованиях противоопухолевой и лучевой терапии у животных. Фантомы, изготовленные из тканевых эквивалентов, могут быть использованы для измерения и проверки распределения дозы облучения, обеспечивая точность планов лучевой терапии домашних животных и проведение калибровки оборудования [18].

В ветеринарии трехмерные тканевые эквиваленты позволяют создавать персонализированные модели опухолей животных с использованием различных клеток и биомаркеров для подбора таргетной химиотерапии и иммунотерапии при лечении онкологических заболеваний [12]. Также тканевые эквиваленты кожи и соединительной ткани, сконструированные из соответствующих клеточных культур и матрикса, могут быть использованы для лечения ожогов животных и являются перспективным направлением в лечении ран у животных в целом [19, 12]. В мировой практике накоплен значительный опыт в этом отношении [20, 12], однако в Российской Федерации до сих пор отсутствует производство доступных тканевых эквивалентов с клетками для лечения ран как человека, так и животных, поскольку не разработаны стандартизированные протоколы выделения клеток, подбора доноров и получения биоэквивалентов. Таким образом, цель исследования — разработать методику создания тканевых эквивалентов соединительной ткани, выполняющей важнейшие функции в организме, из биоматериалов кролика.

Материалы и методы. Исследование проведено в период с 13 ноября 2023 г. по 17 марта 2025 г. на факультете «Биоинженерия и ветеринарная медицина» ДГТУ (г. Ростов-на-Дону): все эксперименты с клеточными культурами выполнены в лаборатории клеточных технологий; содержание и работа с лабораторными животными осуществлялась в виварии факультета в соответствии с действующими нормативными актами.

В качестве животных-доноров использовались взрослые самцы кролика Oryctolagus cuniculus domesticus породы советская шиншилла (n=3). Для выделения ММСК фрагменты жировой ткани массой 2 г были взяты из большого сальника путем чрескожной биопсии; для выделения фибробластов были взяты биоптаты кожи живота.

Для выделения ММСК фрагменты жировой ткани большого сальника выдерживали 60 мин в 0,2 %-ном растворе коллагеназы в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко (DPBS) при температуре 37 °C с постоянным перемешиванием. После фильтрации получившейся суспензии через клеточное сито осаждали клеточную фракцию с помощью центрифугирования. Осадок вносили в культуральные флаконы со средой DMEM/F12, в которую добавляли 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 1 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека-2. Выделенную культуру клеток пересевали в течение пяти пассажей, после чего криоконсервировали.

Фибробласты выделяли из биоптатов кожи: после обработки антисептиком биоптаты асептически иссекали ножницами и переносили на 15 мин в подогретый до температуры 37 °C раствор трипсина для диссоциации клеток. Затем осаждали клетки центрифугированием, вносили в культуральные флаконы со средой DMEM с 10 % ФБС, антибиотиками и антимикотиками и инкубировали при 37 °C с 5 % CO₂. Используя свойство фибробластов быстро адгезироваться к поверхности флаконов, для сепарации их от других типов клеток через 4 ч флаконы промывали от неприкрепившихся клеток и вносили новую питательную среду, через 2 ч процедуру повторяли, после чего культивировали выделенные клетки до субконфлуэнтного монослоя. Субкультивирование фибробластов осуществляли без добавления антибиотиков и антимикотиков.

ММСК подвергали липогенной и миогенной дифференцировке. Первую использовали для получения липобластов, необходимых для формирования биоэквивалента соединительной ткани. Миогенная дифференцировка служила маркером мультипотентности выделенных стволовых клеток.

В качестве индукторов адипогенной дифференцировки использовалась среда DMEM с 4 мг/л глюкозы, 10 % ФСБ, 1 мкмоль дексаметазона, 100 мкмоль индометацина, 500 мкмоль 3-изобутил-1-метилксантина и 10 мкг/мл инсулина [21]. Воздействие индукторов на клетки осуществлялось в течение 10 суток, после чего клетки содержались в стандартной среде DMEM. В качестве отрицательного контроля дифференцировки ММСК культивировали в полной среде DMEM без индукторов. Маркером дифференцировки являлось образование в цитоплазме клеток липидных капель [22].

Для индукции миогенной дифференцировки использовали среду DMEM с 4 мг/л глюкозы, 10 % ФБС, 10 мкмоль 5-азацитидина и 50 мкмоль гидрокортизона. Воздействие индукторов проводилось в течение 15 суток, после чего клетки содержались в стандартной среде DMEM. В качестве отрицательного контроля дифференцировки ММСК культивировали в полной среде DMEM без индукторов. Маркером миогенной дифференцировки считали слияние клеток с образованием миотрубочек [23].

Для подсчета клеток на всех этапах культивирования применялся усовершенствованный алгоритм на основе искусственного интеллекта YOLOv8S-seg, разработанный и описанный нами ранее [24].

Для создания тканевых эквивалентов соединительной ткани был применен метод 3D-биопечати. Для приготовления биочернил порошок альгината натрия стерилизовали под ультрафиолетовым светом в боксе биологической безопасности в течение 40 мин. Затем компоненты растворяли DPBS без кальция и магния в концентрации 30 мг/мл. 3 мл получившегося гидрогеля переносили в шприц объемом 5 мл и вносили фибробласты и липобласты в соотношении 1:1 в количестве 2×10⁶ клеток на 1 мл гидрогеля путем смешивания между двумя шприцами с гидрогелем, соединенными адаптером.

Получившиеся биочернила переносили в инжектор 3D-биопринтера, собранного на базе Anet А8 (Anet, Китай) и доработанного самостоятельно, как описано ранее в [21], и осуществляли процесс печати по заданной цифровой модели со следующими параметрами: размеры объекта 30×40×3 мм, высота слоя — 0,2 мм, количество периметров — 0, количество сплошных слоев снизу — 0, количество сплошных слоев сверху — 0, заполнение — 8 %, тип заполнения — прямолинейное, угол заполнения — 90°, скорость заполнения — 10 мм/с, диаметр сопла — 0,2 мм, диаметр прутка — 1,2 мм, множитель подачи экструдера — 1,3. Печать проводилась в боксе микробиологической безопасности при комнатной температуре в чашках Петри. После печати получившиеся скаффолды заливали раствором CaCl₂ (100 мг/мл) на 10 мин для стабилизации альгината. После отвердевания скаффолды переносили в чашки Петри со средой DMEM и помещали в CO₂-инкубатор при 37 °C на 72 ч со сменой среды каждые 12 ч.

После 72 ч инкубации из рандомных участков тканевых эквивалентов были отобраны образцы для микроскопического анализа и проведена их соответствующая пробоподготовка. Морфологические свойства полученных тканевых эквивалентов были изучены при помощи светового микроскопа Olympus BX53 (Olympus, Япония), конфокального лазерного сканирующего микроскопа Infinity Line (Abberior Instruments, Германия) и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1011 (Jeol, Япония).

Результаты исследования. Использованные протоколы выделения и дифференцировки клеток позволили нам получить стабильные клеточные культуры, которые сохраняли фенотип и динамику роста при субкультивировании в течение 25 пассажей для фибробластов и липобластов и 12 пассажей для миосателлитных клеток (рис. 1).

Внешний вид стабилизированного ионами Ca²⁺ конструкта после 3D-биопечати представлен на рис. 2.

На рис. 3 представлена микрофотография полутонких срезов фрагмента конструкта после 72 ч культивирования. В его составе видны равномерно распределенные в матриксе клетки округлой и веретенообразной формы с вытянутыми отростками и выростами цитоплазмы.

Трехмерная реконструкция окрашенного SYTOX® Green фрагмента тканевого эквивалента после 72 ч культивирования (рис. 4) демонстрирует целостность ядер клеток и нормальную плотность хроматина.

Данные трансмиссионной электронной микроскопии показывают ультраструктуру клеток в составе тканевого эквивалента и их межклеточное взаимодействие
(рис. 5–6). На электронграммах визуализируются клетки двух типов с ультраструктурными признаками фибробластов и липобластов. Оба типа клеток имеют веретенообразную или треугольную, с разветвленными тонкими отростками, направленными преимущественно вдоль тел клеток, форму. Помимо отростков клетки имеют выросты цитоплазмы неправильной формы.

Также отмечается высокая плотность клеток в составе конструкта, которая свидетельствует об увеличении их количества в течение 72 ч культивирования,
т.к. такая плотность недостижима в исходной концентрации, использовавшейся при печати (2×10⁶ клеток на 1 мл гидрогеля). Клетки в составе конструкта плотно прилегают друг к другу и контактируют мембранами тел и отростков (рис. 5). Клетки содержат ядра правильной формы с мелкодисперсным хроматином, в ядрах визуализируются одно-два крупных ядрышка — признак активности фибробластов [25–27]. В некоторых случаях ядра клеток имели инвагинации и выпячивания кариолеммы. Цитоплазма фибробластов насыщена органеллами, что отражает высокий уровень внутриклеточного метаболизма. В цитоплазме визуализируются многочисленные митохондрии, шероховатый эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, лизосомы, центриоли, мультивезикулярные тельца. Цитоплазма липобластов содержит множество включений в виде округлых осмиефильных капель, что также подтверждает факт липогенной дифференцировки ММСК. У клеток развитая сеть эндоплазматического ретикулума, он занимает большую часть цитоплазмы и визуализируется как стопки извитых трубочек и продолговатые цистерны, усеянные рибосомами на стороне, обращенной к цитоплазме. Также не прикрепленные к ретикулуму рибосомы равномерно распределены по всей цитоплазме.

На электронграммах фибробластов при большем увеличении заметна активность комплексов Гольджи, синтезирующих проколлаген (рис. 6 а). В комплексах Гольджи визуализируются диктиосомы, транспортные пузырьки и цистерны. Некоторые цистерны расширены и заполнены осмиефильным электронноплотным веществом, похожим на спутанные нити, что, вероятно, является молекулами проколлагена. Содержимое пузырьков постепенно конденсируется и превращается в транспортные вакуоли, собирающиеся в секреторные гранулы на обращенной к плазматической мембране стороне комплекса Гольджи. Такая картина активности комплексов Гольджи также указывает на высокую секреторную активность клеток в течение 72 ч в составе конструкта.

Еще одним важным визуализируемым элементом межклеточного взаимодействия является наличие плотных контактов (рис. 6 а, б), которые выглядят как два осмиефильных уплотнения с межклеточной щелью в месте соприкосновения мембран соседних клеток. Плотный контакт — это высокоспециализированный селективный барьер, обеспечивающий прямое соприкосновение белков двух смежных плазматических мембран и позволяющий группам клеток функционировать в качестве структурных единиц. При этом в образце тканевого эквивалента были выявлены плотные контакты как между клетками одного типа (фибробласт/фибробласт и липобласт/липобласт), так и между клетками разных типов: например, на рис. 6 а, б показан плотный контакт между фибробластом и липобластом.

Развитая сеть эндоплазматического ретикулума  [28], высокая активность аппарата Гольджи [29] и многочисленные рибосомы указывают на активные процессы синтеза белка и подтверждают жизнеспособность и хорошую выживаемость клеток в составе тканевого эквивалента как минимум в течение 72 ч культивирования. Данные трансмиссионной электронной микроскопии также подтверждают наличие маркеров дифференцировки клеток: липидные капли у липобластов и молекулы проколлагена у фибробластов.

Обсуждение и заключение. В рамках исследования был разработан новый тканеинженерный метод для производства культивируемых трехмерных тканевых эквивалентов соединительной ткани с использованием дифференцированных ММСК кролика и 3D-биопечати. Воздействие in vitro набора индукторов, включающего среду DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л, 10 % ФБС, 1 μM дексаметазона, 100 μM индометацина, 500  μM 3-изобутил-1-метилксантина и 10 мкг/мл инсулина, на ММКС кролика обеспечило их адипогенную дифференцировку, функциональным маркером которой явилось образование липидных капель. Воздействие in vitro набора индукторов, включающего среду DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л, 10 % ФБС, 10 µМ 5-азацитидина и 50 µМ гидрокортизона, на ММКС кролика обеспечило их миогенную дифференцировку, функциональным маркером которой явилось образование миотрубочек. Метод экструзионной 3D-биопечати обеспечил формирование трехмерных тканевых эквивалентов соединительной ткани, в составе которых дифференцированные клетки кролика сохраняли жизнеспособность и метаболическую активность, формируя плотные контакты и секреторные везикулы в течение как минимум 72 ч. Морфологический анализ полученного биоэквивалента, включающий конфокальную и просвечивающую электронную микроскопию, подтвердил жизнеспособность и высокую метаболическую активность клеток, что указывает на их потенциал для поддержания функциональности конструкта.

Предложенный метод создания тканевых эквивалентов может быть широко использован: в клинической ветеринарии — для лечения дефектов и повреждений соединительной ткани; в экспериментальной ветеринарии — в качестве модели для изучения закономерностей морфогенеза, цито-, гисто- и органогенеза, дифференцировки клеток и внутриклеточных структур, межклеточных взаимодействий, регенераторных процессов в индивидуальном развитии, их адаптации к воздействию экзогенных и эндогенных факторов у животных на макро-, микро- и ультраструктурном уровне с использованием морфологических и других методов исследования, скрининга новых лекарственных соединений, а также в качестве фантомов для разработки подходов в лучевой терапии и диагностике. Кроме того, данный метод может быть транслирован в область разработки культивируемых мясных продуктов, так как позволяет получить конечный продукт со свойствами, тождественными тканям продуктивных животных, включая структурную целостность и органолептические свойства.

Явным недостатком технологии является ее высокая стоимость и технологическая сложность крупномасштабного клеточного культивирования в типовых лабораториях. Высокая стоимость определяется, в первую очередь, самым дорогим компонентом культуральной среды — сывороткой плодов коров. Несмотря на многочисленные попытки производства бессывороточных сред и поиска заменителей сыворотки, на данный момент эффективность их при культивировании уступает сыворотке. Для удешевления и оптимизации крупномасштабного культивирования клеток целесообразно использовать биореакторы, что, в совокупности с применением 3D-биопринтера, повышает требования к компетенциям операторов.

К технологическим преимуществам данного метода относится возможность стандартизации и высокая воспроизводимость, что обеспечивается условиями 3D-биопечати: концентрация клеток в гидрогеле и их распределение в конструкте будут одинаковы при воспроизведении, так как печать проводится по заданному цифровому шаблону и ее параметры контролируются на аппаратном и программном уровнях, а применение алгоритмов на основе искусственного интеллекта для контроля клеточного культивирования значительно нивелирует влияние человеческого фактора на конечный результат.