Разработка методики получения биоэквивалента соединительной ткани кролика

Введение. Клеточная терапия и тканевая инженерия обладают значительным потенциалом применения в ветеринарии, однако использование данных технологий в Российской Федерации в настоящее время ограничено из-за отсутствия стандартизированных протоколов выделения клеток, подбора доноров и создания тканевых эквивалентов. Особую актуальность для клинической ветеринарии имеет разработка методики получения биоэквивалента соединительной ткани, ведь она составляет до половины массы тела и является основой для нормального функционирования кожи, слизистых оболочек и внутренних органов животных. Цель исследования — разработать методику получения тканевого эквивалента соединительной ткани кролика.
Материалы и методы. Исследование проведено на базе ДГТУ в период с 13 ноября 2023 г. по 17 марта 2025 г. Объектом исследования выступили мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) и фибробласты взрослых самцов кролика. Ферментными методами были выделены ММСК из большого сальника и фибробласты из кожи животных. Получены стабильные культуры клеток, исследован их дифференцировочный потенциал при миогенной и липогенной индукции in vitro. С применением экструзионной 3D-биопечати созданы эквиваленты соединительной ткани, морфологические свойства которой изучены с помощью световой, конфокальной и электронной микроскопии.
Результаты исследования. Индукция наборами факторов обеспечила дифференцировку ММСК в адипо- и миогенном направлении. Адипогенная дифференцировка сопровождалась образованием липидных капель, миогенная — формированием миотрубочек. 3D-биопечать позволила сформировать эквиваленты соединительной ткани с сохранением жизнеспособности клеток, развитием межклеточных контактов и активной секрецией в течение не менее 72 ч.
Обсуждение и заключение. Разработан новый подход к получению тканевых эквивалентов соединительной ткани кролика благодаря оптимизации методов выделения и дифференцировки ММСК. Сформированные конструкты продемонстрировали морфофункциональную активность, что подтверждает перспективность их применения в клинической ветеринарии для регенерации соединительной ткани и в экспериментальных исследованиях.

1. Sharun K, El-Husseiny HM, Muthu S. Editorial: Advances In Veterinary Tissue Engineering: Unlocking Potential with Cell-Free and Cell-Based Methods. Frontiers in Veterinary Science. 2025;12:1591272. https://doi.org/10.3389/fvets.2025.1591272

2. Yun SH, Lee DY, Lee J, Mariano EJ, Choi Yeongwoo, Park Jinmo, et al. Current Research, Industrialization Status, and Future Perspective of Cultured Meat. Food science of animal resources. 2024;44(2):326–355. https://doi.org/10.5851/kosfa.2024.e13

3. Hubrecht RC, Carter E. The 3Rs and Humane Experimental Technique: Implementing Change. Animals. 2019;9(10):754. https://doi:10.3390/ani9100754

4. Sulakhiya K, Paliwal R, Kisku A, Sahu M, Aditya S. Soni P, et al. Experimental Tools as an “Alternative to Animal Research” in Pharmacology. In book: Singh D, Tiwari P (Eds.). Software and Programming Tools in Pharmaceutical Research. Bentham Science Publishers; 2024. P. 170–206. https://doi.org/10.2174/97898152230191240101

5. Amelian A, Wasilewska K, Megias D, Winnicka K. Application of Standard Cell Cultures and 3D in Vitro Tissue Models as an Effective Tool in Drug Design and Development. Pharmacological Reports. 2017;69:861–870. https://doi.org/10.1016/j.pharep.2017.03.014

6. Мелешина А.В., Быстрова А.С., Роговая О.С., Воротеляк Е.А., Васильев А.В., Загайнова Е.В. Тканеинженерные конструкты кожи и использование стволовых клеток для создания кожных эквивалентов (обзор). Современные технологии в медицине. 2017;9(1):198–220. https://doi.org/10.17691/stm2017.9.1.24

7. Шкурупий В.А., Ким Л.Б., Ковнер А.В., Черданцева Л.А. Соединительная ткань и проблемы ее патологических состояний. Бюллетень сибирской медицины. 2017;16(4):75–85. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2017-4-75–85

8. Zushin PH, Mukherjee S, Wu JC. FDA Modernization Act 2.0: Transitioning beyond Animal Models with Human Cells, Organoids, and AI/ML-Based Approaches. The Journal of Clinical Investigation. 2023;133(21):e175824. https://doi.org/10.1172/JCI175824

9. Ravikumar B, Cichońska A, Sahni N, Aittokallio T, Rahman R. Advancements in Rational Multi‐Targeted Drug Discovery: Improving the Efficacy‐Safety Balance of Small Molecule Cancer Therapeutics. In book: Peters JU (Ed.). Polypharmacology: Strategies for Multi‐Target Drug Discovery. John Wiley & Sons, Inc.; 2025. P. 109–125. https://doi.org/10.1002/9781394182862.ch9

10. Hu J, Lin YY, Chen PJ, Watashi K, Wakita T. Cell and Animal Models for Studying Hepatitis B Virus Infection and Drug Development. Gastroenterology. 2019;156(2):338–354. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2018.06.093

11. Harb A, Fakhreddine M, Zaraket H, Saleh FA. Three-Dimensional Cell Culture Models to Study Respiratory Virus Infections Including COVID-19. Biomimetics. 2021;7(1):3. https://doi:10.3390/biomimetics7010003

12. Головин С.Н. Кириченко Е.Ю., Седова Д.А., Ермаков А.М. Перспективы применения клеточной терапии в ветеринарии. Международный вестник ветеринарии. 2025;4. (в печати).

13. Armitage AJ, Miller JM, Sparks TH, Georgiou AE, Reid J. Efficacy of Autologous Mesenchymal Stromal Cell Treatment for Chronic Degenerative Musculoskeletal Conditions in Dogs: A Retrospective Study. Frontiers in Veterinary Science. 2023;9:1014687. https://doi.org/10.3389/fvets.2022.1014687

14. Goel S, Gandhi S, Dubey S, Shah M, Saini S, Arora P, et al. Stem Cell Therapy: Promises and Challenges in Treating Animal Diseases. In book: Mukhopadhyay CS, Choudhary RK, Panwar H, Malik YS (Eds.). Biotechnological Interventions Augmenting Livestock Health and Production. Livestock Diseases and Management. Singapore: Springer; 2023. P. 13–38. https://doi.org/10.1007/978-981-99-2209-3_2

15. Voga M, Kovač V, Majdic G. Comparison of Canine and Feline Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells/Medicinal Signaling Cells with Regard to Cell Surface Marker Expression, Viability, Proliferation, and Differentiation Potential. Frontiers in Veterinary Science. 2021;7:610240. https://doi.org/10.3389/fvets.2020.610240

16. Fraile AP, González-Cubero E, Martínez-Flórez S, Olivera ER, Villar-Suárez V. Regenerative Medicine Applied to Musculoskeletal Diseases in Equines: A Systematic Review. Veterinary Sciences, 2023;10(12):666. https://doi.org/10.3390/vetsci10120666

17. Vickram AS, Infant SS, Manikandan S, Sowndharya BB, Gulothungan G, Chopra H. 3D Bio-Printed Scaffolds and Smart Implants: Evaluating Functional Performance in Animal Surgery Models. Annals of Medicine and Surgery 2025;87(6):3618–3634. https://doi.org/10.1097/MS9.0000000000003333

18. Gallivanone F, D’Ambrosio D, Carne I, D’Arcangelo Micol, Montagna P, Giroletti E, et al. A tri-modal tissue-equivalent anthropomorphic phantom for PET, CT and multi-parametric MRI radiomics. Physica Medica. 2022;98:28–39. https://doi.org/10.1016/j.ejmp.2022.04.007

19. Tello LH. Burns in Small Animals. Proceedings of 38th World Congress of World Small Animal Veterinary Association (WSAVA), Auckland, New Zealand. March 2013. https://www.vin.com/apputil/content/defaultadv1.aspx?id=5709840&pid=11372& (accessed: 16.08.2023).

20. Chogan F, Chen Y, Wood F, Jeschke MG. Skin Tissue Engineering Advances in Burns: A Brief Introduction to the Past, the Present, and the Future Potential. Journal of Burn Care & Research. 2023;44(Suppl_1):S1–S4. https://doi.org/10.1093/jbcr/irac127

21. Golovin SN, Kirichenko EY, Khanukaev MM, Logvinov AK. 3D Bioprinting of Hybrid Cultured Meat from Rabbit Cells and Sunflower Protein. Foods and Raw Materials. 2026;14(1):52–60. https://doi.org/10.21603/2308-4057-2026-1-659

22. Lund P, Pilgaard L, Duroux M, Fink T, Zachar V. Effect of Growth Media and Serum Replacements on the Proliferation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells. Cytotherapy. 2009;11(2):189–197. https://doi.org/10.1080/14653240902736266

23. Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. John Wiley & Sons, Inc. 2010; 732 p. https://doi.org/10.1002/9780470649367

24. Nabiullina R, Golovin S, Kirichenko E, Petrushan M, Logvinov A, Kaplya M, et al. 3D Bioprinting of Cultivated Meat Followed by the Development of a Fine-Tuned YOLO Model for the Detection and Counting of Lipoblasts, Fibroblasts, and Myogenic Cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 2025;30(3):36266. https://doi.org/10.31083/FBL36266

25. Hernandez-Verdun D, Roussel P, Thiry M, Sirri V, Lafontaine DL. The Nucleolus: Structure/Function Relationship in RNA Metabolism. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2010;1(3):415–431. https://doi.org/10.1002/wrna.39

26. Grummt I. The Nucleolus—Guardian of Cellular Homeostasis and Genome Integrity. Chromosoma. 2013;122(6):487–497. https://doi.org/10.1007/s00412-013-0430-0

27. Dubois ML, Boisvert FM. The Nucleolus: Structure and Function. In book: Bazett-Jones D, Dellaire G (Eds.). The Functional Nucleus. Cham: Springer; 2016. P. 29–49. https://doi.org/10.1007/978-3-319-38882-3_2

28. Csala M, Bánhegyi G, Benedetti A. Endoplasmic Reticulum: A Metabolic Compartment. FEBS Letters. 2006;580(9):2160–2165. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2006.03.050

29. Wang H, Zhang X, Xiu T, Wang H, Li P, Tang B. Fluorescence Probes for Sensing and Imaging within Golgi Apparatus. Coordination Chemistry Reviews, 2024;502:215618. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2023.21