Исследование морфофункционального состояния легких и центральных органов детоксикации джунгарских хомячков (Phodopus sungorus) при длительном воздействии аэрозоля электронных сигарет

Введение. Электронные системы доставки никотина (ЭСДН) впервые в широком доступе появились в 2006 г. на территории Европы и приобрели статус самой популярной альтернативы обычным сигаретам [1–6], особенно среди молодых людей и подростков от 14 лет [1][7–10]. Основную опасность для экологии представляет многокомпонентный состав жидкостей для электронных сигарет (ЭС), насчитывающий более 30 токсичных химических веществ, среди которых карбонильные соединения (альдегиды, кетоны), металлы, пропиленгликоль, глицерин [11–16]. При этом карбонильные соединения представлены чрезвычайно токсичными веществами, такими как акролеин (максимальная разовая предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе 0,03 мг/м³) и формальдегид (ПДК 0,05 мг/м³), которые, как минимум, являются раздражителями слизистой оболочки внутренних органов [17]. Акролеин также вызывает мутагенез у бактерий и дрожжей, проявляет мутагенные свойства на культурах клеток млекопитающих, снижает активность некоторых компонентов иммунной защиты [18].

Исследования влияния двух обязательных составляющих ЭСДН – пропиленгликоля и глицерина — показывают, что пропиленгликоль, попадая в альвеолы в виде аэрозоля, способствует разрушению сурфактанта, обеспечивающего растяжимость легкого и препятствующего слипанию легочной ткани. Данное воздействие приводит к спаданию ткани (ателектазу), а соседние участки подвергаются компенсаторному перерастяжению, вызывая эмфизему. Также пропиленгликоль рассматривается как стимулирующий фактор при формировании плоскоклеточной метаплазии гортани. При вдыхании же паров глицерина у крыс наблюдали метаплазию эпителия надгортанника [19]. Также известно, что при нагревании глицерина в электронной сигарете до 500 ^оС, он трансформируется в акролеин, о котором упомянуто выше.

Кроме основных составляющих в ЭСДН представлены ароматизаторы в ассортименте. Общепризнанный безопасный список (GRAS) включает ароматизаторы для проглатывания, однако исследования по вдыханию аэрозолей, содержащих такие вещества, немногочисленны. Например, доказано, что вдыхание диацетила, содержащегося в жидкости, вызывает облитерирующий бронхиолит — так называемую «попкорновую болезнь легких» (феномен был выявлен в начале 2000-х в связи с массовыми заболеваниями работников фабрик по изготовлению попкорна) [20]. На некоторых предприятиях диацетил заменили на ацетилпропионил, однако и тогда исследователям из Национального института охраны труда США (NIOSH) пришлось отметить существенные отклонения в показателях спирометрии работников таких предприятий [21][22]. В ЭСДН используют эти вещества для придания сигаретам маслянистого или карамельного вкуса, хотя ацетилпропионил имеет доказанную легочную токсичность для млекопитающих. Так, у крыс, подвергшихся его воздействию, развиваются фиброз и некроз тканей дыхательных путей; у мышей отмечали большее сужение бронхов в ингаляционном тесте (провокация метахолином) [23]. В целом, несмотря на более чем 7000 вкусов ЭСДН, обусловленных ассортиментом ароматизаторов на рынке [24], опубликовано только три работы, посвященных воздействию ароматизирующих веществ на организм [15][25][26].

В литературных источниках можно найти немало информации о влиянии электронных сигарет и вейпов на организм млекопитающих. Например, доказано, что воздействие пара ЭСДН изменяло легочную функцию крыс [27]; снижало проводимость ионных каналов в клетках бронхиального эпителия овец, а также приводило к гиперконцентрации слизи [28]. В легких крыс зафиксировано значительное увеличение провоспалительных цитокинов [29], а также развитие липоидной пневмонии [30]. Влияние на жизненно важные органы оказывает и опаривание безникотиновой жидкостью, при этом зарегистрировано утолщение межальвеолярных перегородок в легких крыс, заполнение мелких бронхов слизью, закрывающей просвет, замечена лимфоидная инфильтрация в мелких бронхах. В почках зафиксировано троекратное расширение просвета капсул Шумлянского-Боумена, повреждены почечные тельца и эпителий проксимальных канальцев [31]. Отмечено, что среди собак мегаполисов участились бронхиты, пневмонии и онкологические заболевания легких [32]. В ряде работ отмечена гепатотоксичность жидкостей для электронных сигарет в отношении крыс [33]. Однако информация о биологических эффектах длительного использования электронных сигарет и вейпов в научной литературе освещена недостаточно.

Цель настоящей работы — исследовать морфофункциональные изменения легких и центральных органов детоксикации джунгарских хомячков (Phodopus sungorus) при длительном воздействии аэрозоля электронных сигарет и вейпов.

Материалы и методы. Исследование проводили в 2021 г. на базе Института систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук и Научно-образовательного центра «Экспериментальная и прикладная биология» ФГБОУ ВО НГПУ (г. Новосибирск). Работа выполнена на лабораторной колонии джунгарского хомячка (Ph. sungorus), содержащейся при весеннем фотопериоде (12L/12D), температуре +22 ºC в стандартных клетках (26×36×20 см). Экспериментальные животные (n=36) были случайным образом разделены на опытную и контрольную группы: в опытную группу вошли 10 самцов и 10 самок; в контрольную группу — 8 самцов и 8 самок.

В течение 80 дней эксперимента хомячков опытной группы подвергали экспозиции паром, полученным при нагревании жидкости X-3 Yoghurt Pear (производитель PRIDE VAPE, Россия), содержащей глицерин и пропиленгликоль в соотношении 70/30, никотин в дозе 3 мг/мл и ароматизаторы «Йогурт» и «Груша». Экспозиция паром заключалась в двукратном засасывании пара сигареты с помощью насоса и полном заполнении камеры с интервалом в 5 мин. Спустя 10 мин животных доставали из контейнеров. Процедуру проводили каждый день, по 2 раза с интервалом в 2 ч. Хомячков контрольной группы переносили в комнату для экспериментов, предварительно удалив из помещения воздух с частицами аэрозоля, затем помещали в затравочные камеры без экспозиции паром ЭСДН.

Экспериментальная установка включает контейнер, где животное подвергают экспозиции паром. Для этого использовали пластиковые пищевые контейнеры 10×17×4 см, V 0,7 л, с плотно закрывающейся крышкой. Для оптимизации процесса единовременно использовали два контейнера, соединенных с помощью шлангов (Boutte, Италия), 4 мм. Для нагнетания газа в камеры использовали насос (Intex, Китай), V ~ 1,594 л.

Для изучения морфофункционального состояния легких и центральных органов детоксикации у животных обеих групп после декапитации забирали легкие, почки, печень и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Кусочки тканей данных органов обезвоживали и просветляли согласно протоколу проводки тканей в изопропиловом спирте. Исследуемые образцы заливали в парафиновые блоки и далее на ротационном полуавтоматическом микротоме Slee Medical CUT 5062 (SLEE Medical GmbH, Германия) изготавливали серийные срезы толщиной 6 мкм, которые монтировали на предметные стекла смесью белка и глицерина в пропорции 1:1. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином Бемера и эозином. Распределение коллагена определяли по методу Маллори [34].

Гистологические препараты органов изучали в проходящем свете с помощью микроскопа Axio Imager M2 c возможностью анализа изображений AxioVision Z2 M2 (Carl Zeiss, Германия). Съемка изображений осуществлялась CCD-камерой AxioCam HR c программным обеспечением Zen Lite (Carl Zeiss, Германия). На всех снимках отображена масштабная линейка.

Статистическую обработку данных проводили на основе вычисления средних арифметических (х) и их ошибок (Sx). Различия показателей опытных групп по отношению к аналогичным показателям контрольной группы оценивали методом вариационной статистики по t-критерию Стьюдента и считали достоверными при р ≤ 0,05. Все расчеты проводили по общепринятым формулам с использованием пакета программ Microsoft Excel 2010.

Результаты исследования. Морфологическая картина паренхимы легкого животных контрольной группы в целом соответствует структуре данного органа в норме (рис. 1 а, б, в). На препаратах, окрашенных гематоксилином Бемера и эозином, отчетливо заметны бронхи различного калибра (рис. 1 а, в). В крупных бронхах эпителий многорядный, столбчатый (рис. 1 в). В просвете идентифицируется слизистый секрет и слабо выраженная десквамация эпителия преимущественно на участке перехода терминальных бронхиол в респираторные. Внутридольковые кровеносные сосуды заполнены плазмой крови. Морфологическая картина альвеол, в том числе клеток эндотелия капилляров, альвеолоцитов 1-го и 2-го типов, а также макрофагов соответствуют норме (рис. 1 б, в) [35][36].

В исследованных образцах ткани легкого животных опытной группы обнаружены изменения, которые затрагивают паренхиму и интерстиции легкого. На обзорных препаратах заметны чередования очагов ателектаза и эмфиземы (рис. 2 а). В просвете бронхов и бронхиол выявляются комплексы десквамированных эпителиальных клеток (рис. 2 а, б). Эпителий слизистой оболочки теряет многорядное строение. При большом увеличении заметно, что клетки цилиндрического эпителия теряют реснички. В собственной пластинке слизистой оболочки заметны признаки отека и набухания волокнистых компонентов соединительной ткани. Кровеносные сосуды собственной пластинки чрезмерно расширены, заполнены плазмой и клетками крови. Среди последних идентифицируются лейкоциты (рис. 2 в).

Межальвеолярные перегородки и стенки альвеолярных мешочков утолщены за счет плазматического пропитывания и полнокровия капилляров (рис. 2 а). В просветах альвеол обнаруживаются макрофаги, сегментоядерные нейтрофилы и лимфоциты (рис. 2 в). Типичным признаком образцов легких животных опытной группы является чрезмерное увеличение количества альвеолоцитов 2-го типа (рис. 2 в). Среди эпителиоцитов 1-го типа нередко встречаются клетки с пикнотичными ядрами. Капилляры и венулы полнокровны. Периваскулярная соединительная ткань разрыхлена и отечна. Клетки эндотелия капилляров альвеол набухшие. Ядро крупное, как правило, с высоким содержанием гетерохроматина и выбухает в просвет капилляров (рис. 2 г).

Типичным признаком для ткани легкого животных опытной группы является локализация гомогенного вещества черного цвета среди клеток эпителия бронхов и в интерстиции альвеолярных мешочков (рис. 3 а). При проведении гистохимической реакции на коллаген по Маллори обнаруживается интенсивное окрашивание срезов на данный белок в строме на периферии сегментарных, внутрисегментарных и внутридольковых бронхов, артерий и вен легкого. В интерстиции легочной ткани реакция на коллаген умеренная (рис. 3 б, в).

При изучении образцов почек хомячков опытной группы обнаружено статистически значимое снижение всех исследуемых параметров почечных клубочков по сравнению с контролем, что говорит о снижении функциональной активности почки животных, подвергнувшихся экспозиции паром (таблица 1).

Сосуды клубочка чрезмерно расширены, заполнены плазмой и клетками крови. Эндотелиальные и мезангиальные клетки набухшие, эритроциты с признаками сладж-феномена (рис. 4 б, г). Характерным патоморфологическим признаком образцов почек животных опытной группы является высокое содержание клеток нефротелия с признаками их летального повреждения во всех отделах нефрона.

Как правило, цитоплазма гибнущих нефроцитов не окрашивается гематоксилином и эозином, ядро гиперхромное, ядерная мембрана не идентифицируется (рис. 4 а, в). В просвете дистальных и проксимальных извитых канальцев, а также цитоплазме нефроцитов, заметно мелкогранулярное вещество черного цвета (рис. 4 в). Данный признак особенно ярко проявляется в просвете собирательных трубочек и среди клеток эпителия данного отдела нефрона (рис. 4 в).

На светооптическом уровне гепатоциты центролобулярной и перипортальной зон дольки печени животных опытной группы различаются по тинкториальным свойствам [37]. Цитоплазма светлых гепатоцитов интенсивно базофильная и заполнена оксифильным материалом (рис. 5 а, б). В образцах препаратов печени хомячков опытной группы, окрашенных гематоксилином и эозином, отчетливо заметно, что по сравнению с контролем в паренхиме органа преобладают гепатоциты с пикнотичными ядрами (рис. 5 а, в). При детальном изучении препаратов становится очевидным, что такие клетки представляют собой гибнущие апоптозом гепатоциты. Их отличительными характеристиками является пикноз клеток и маргинация хроматина в ядре (рис. 5 б). Преобладание таких клеток в центролобулярной зоне, ответственной за детоксикацию, позволяет считать, что печень животных опытной группы испытывает функциональную нагрузку, выходящую за рамки физиологического оптимума, и ее адаптивные ресурсы не способны обеспечивать адекватную реакцию на действие токсических веществ (рис. 5 б).

Обсуждение и заключение. Результаты проведенного исследования дают все основания считать, что при выбранном дизайне экспозиции хомячков газовой смесью вейпов в легких, печени и почках происходят структурно-функциональные изменения. В легких обнаруживается повреждение эпителия бронхов, альвеолярного эпителия и эндотелия микроциркуляторного русла. Данные световой микроскопии не дают возможности идентифицировать повреждение структур аэрогематического барьера, однако обнаруженные грубые морфологические преобразования в данном компартменте указывают на нарушение структурно-функциональной организации базальных мембран капилляров и эпителиоцитов. Как известно, это ведет к нарушению микроциркуляции в легких, повышению проницаемости легочных капилляров, развитию отека легких. Именно этим можно объяснить наличие в паренхиме легкого интерстициального и альвеолярного отека, дистелектаза (спадения альвеол чередуются с их расширением), которые развиваются не без участия лейкоцитов и макрофагов [38, 39].

В соответствии с принципом комплементарности, который постулирует единство структуры и функции, обнаруженные изменения гемодинамики приводят к нарушению вентиляционно-перфузионных отношений в легочной ткани и газообмена. Высокий уровень содержания в ткани альвеолоцитов 2-го типа можно объяснить повышением их пролиферативной активности в ответ на повреждение альвеолярного эпителия веществами, входящими в состав газовой смеси вейпов.

Считается, что, помимо участия альвеолоцитов 2-го типа в синтезе сурфактанта, они обеспечивают процесс детоксикации. По совокупности обнаруженных изменений в легких патоморфологические признаки очень близки к острому респираторному дистресс-синдрому.

Чрезмерное расширение капилляров клубочка почек при отсутствии его гиперклеточности и отека мезангиума может быть связано с прямым участием биологически активных молекул непосредственно на стенку капилляров, приводящие к их повреждению и расстройству кровообращения. Наличие неидентифицированного гомогенного вещества в просвете проксимальных и дистальных отделов канальцев нефрона, а также собирательных трубочек позволяет считать, что транспорт этого вещества осуществлялся через базальную гломерулярную мембрану и поступает в почечный клубочек из общего кровотока. Снижение морфометрических характеристик структурных компонентов почечного тельца в исследуемых образцах почек животных опытной группы, по сравнению с контролем, дают все основания говорить о нарушении фильтрационно-реабсорбционного механизма почек и развитии почечной недостаточности.

Несмотря на отсутствие выраженных признаков повреждения печени, обилие гибнущих апоптозом темных гепатоцитов центролобулярной зоны дольки печени, эволюционно приспособленных к детоксикации, указывает на причастность к этому процессу токсических веществ, поступающих в печень с кровью.