Эффективность моделирования окислительного стресса у крыс воздействием шума в сравнении с гипертермией и магнитным полем

Введение. При проведении фармакологических и патофизиологических доклинических исследований перед начинающим специалистом зачастую встает вопрос, связанный с выбором экспериментальной модели индукции необходимых для изучения процессов [1–7]. Инициирование процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и последующее формирование окислительного стресса возможно воздействием  гипертермии, магнитного поля, шума: данные модели апробировались и отрабатывались в отношении дозы и длительности экспозиции (суточной, курсовой) на кафедре фармакологии Амурской медакадемии на протяжении многих лет [8–10]. Особую актуальность приобретают исследования, посвященные шумовому воздействию на теплокровный организм ввиду ежегодного увеличения интенсивности акустической нагрузки на человека и животных [11–16]. Безусловно, все вышеперечисленные факторы воздействия способны запускать свободнорадикальные реакции, но хотелось бы выяснить сравнительную эффективность различных моделей в проекции конкретных маркеров окислительного стресса и временного диапазона, в течение которого реагируют параметры прооксидантной/антиоксидантной системы на воздействие стресс-факторов. На наш взгляд, надежность в максимально возможных изменениях показателей системы «перекисное окисление липидов/антиоксидантная защита» и наибольший процент вероятности формирования окислительного стресса укажут на преимущества экспериментальной модели и её востребованность на доклиническом этапе исследований.

Цель работы — проанализировать в сравнительном аспекте влияние шума, гипертермии и магнитного поля на интенсивность процессов перекисного окисления липидов биомембран в эксперименте с лабораторными крысами.

Материалы и методы. Эксперимент проведен в 2023–2024 гг. в научно-исследовательской лаборатории Амурской медакадемии (г. Благовещенск) в соответствии с требованиями, предъявляемыми к доклиническим исследованиям, и одобрен локальным этическим комитетом (выписка из протокола № 9 от 07 декабря 2022). Для осуществления опыта использовали 120 белых беспородных крыс-самцов 2-3 месячного возраста массой 200–250 г. Крысы были разделены на четыре равные по численности группы: в первой группе (интактная) животных не подвергали каким-либо воздействиям; во второй группе (подопытная 1) животных подвергали гипертермии (+40±2 °С 45 мин/день ежедневно в течение 7, 14, 21 дней); в третьей группе (подопытная 2) животных подвергали воздействию магнитного поля (0,4 миллитесла 180 мин/день ежедневно в течение 7, 14, 21 дней); в четвертой группе (подопытная 3) животных подвергали воздействию шума (95–105 дБ 60 мин/день ежедневно в течение 7, 14, 21 дней). В процессе экспериментальных воздействий летальных случаев зарегистрировано не было.

Крыс декапитировали на 7, 14, 21-й дни эксперимента (по 10 голов из каждой группы), кровь животных собирали в охлажденные пробирки с гепарином, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, полученную сыворотку крови хранили при температуре –20 °С до момента исследования. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивали, исследуя содержание в крови крыс: диеновых конъюгатов (по методике И.Д. Стальной), малонового диальдегида (по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой) и основных компонентов антиоксидантной системы (АОС) — церулоплазмина (по методике В.Г. Колба), витамина Е (по методике Р.Ж. Киселевич). В работе использовали спектрофотометр КФК-2мп (Загорский оптико-механический завод, Россия), спектрофотометр UNICO (United Products & Instruments, США), фотоэлектроколориметр Solar PV 1251 C (ЗАО «СОЛАР», Беларусь). 

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel 2016 (Microsoft) и пакета прикладных программ Statisticav.10.0 (Statsoft Inc., США). Количественные показатели были проанализированы на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка (количество животных в группах n< 50). На основе выполненного количественного анализа и графического изображения гистограмм частот было установлено, что преобладающая часть количественных данных не соответствовала нормальному типу распределения, поэтому результаты описывались с помощью расчета медианы (Ме), нижнего и верхнего квартиля (Q₁; Q₃). Межгрупповое сравнение по количественному показателю проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни; статистическую значимость внутригрупповых изменений показателей в динамике — с помощью критерия Вилкоксона; для сравнения значений более чем в двух выборках и с учетом ненормального типа распределения количественных данных использовали непараметрическую альтернативу одномерному (межгрупповому) дисперсионному анализу — критерий Краскела-Уоллиса. Во всех процедурах оценки критический уровень значимости принимался равным 0,05.

Результаты исследования. Установлено, что воздействие шума, магнитного поля и гипертермии запускает в организме однонаправленные неспецифические процессы, связанные с повышением интенсивности свободнорадикального (перекисного) окисления липидов биомембран и формированием окислительного стресса, на что указывает накопление продуктов ПОЛ в плазме крови подопытных крыс. В частности, концентрация диеновых конъюгатов (таблица 1) на фоне экспериментальных воздействий статистически значимо выросла относительно интактных животных: к концу первой недели опыта на 23 % (гипертермия, р < 0,05) и 39 % (шум, р < 0,05) на фоне тенденции к увеличению показателя под влиянием магнитного поля (на 13 %); к концу второй недели уровень первичного продукта пероксидации достоверно увеличился на 27 % (гипертермия), 16 % (магнитное поле), 49 % (шум, р < 0,05); к концу третьей недели — на 31, 17 и 58 % соответственно (р < 0,05). В целом, по влиянию на индукцию диеновой конъюгации липидов экспериментальные воздействия можно расположить в следующей убывающей последовательности: шум > гипертермия > магнитное поле.

Вторичный продукт липопероксидации — малоновый диальдегид (МДА) — реагировал на воздействия изучаемых факторов статистически значимым повышением в сравнении с интактной группой во все контрольные временные точки (таблица 2): на 7-й день опыта МДА вырос на 37 % (гипертермия), 45 % (магнитное поле), 53 % (шум) (р < 0,05); на 14-й день — на 40, 49 и 47 % соответственно (р < 0,05); на 21-й — на 29, 44 и 61 % (р < 0,05). Это позволяет расположить экспериментальные воздействия по эффективности модели следующим образом: шум > магнитное поле > гипертермия.

Таким образом, все апробируемые экспериментальные воздействия являются рабочими в плане повышения уровня маркеров окислительного стресса. При этом магнитное поле более выраженно способствует накоплению вторичного продукта ПОЛ, гипертермия — первичного, на фоне стабильной более выраженной эффективности моделирования стресса воздействием шума, что было подтверждено результатами рангового дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса (таблица 3): во все контрольные точки получены статистически значимые изменения диеновых конъюгатов и малонового диальдегида у крыс, подвергнутых шумовой нагрузке, в сравнении с интактными животными. При этом зарегистрированы статистически значимые преимущества модели шумового влияния над магнитным полем (р=0,000005, 14-й и 21-й дни) и гипертермией (р=0,002039, 14-й день; р=0,001837, 21-й день) по уровню диеновых конъюгатов; по МДА шумовое воздействие превзошло гипертермию к концу опыта (р=0,000561).

Антиоксидантная система снизила свою активность в ответ на воздействие прооксидантных факторов, в частности, уровень церулоплазмина в плазме крови подопытных крыс (таблица 4) достоверно уменьшился на 31 % (гипертермия), 16 % (магнитное поле), 39 % (шум) к концу первой недели экспериментальных воздействий (р < 0,05); на 33, 15 и 42 % соответственно — к концу второй недели (р < 0,05); на 27, 16 и 50 % — к концу третьей (р < 0,05).

На этом фоне концентрация витамина Е (таблица 5) под влиянием магнитного поля была статистически значимо ниже лишь к концу эксперимента; шума — на 14-й (17 %, р < 0,05)  и 21-й день (31 %, р < 0,05); гипертермии — на 7-й (28 %, р < 0,05), 14-й (30 %, р < 0,05) и 21-й день (29 %, р < 0,05).

Таким образом, церулоплазмин более выраженно реагирует при моделировании окислительного стресса акустической нагрузкой (шум > гипертермия > магнитное поле), витамин Е — температурной (гипертермия > шум > магнитное поле). Это отразилось в целом на результатах рангового дисперсионного анализа (таблица 6), которые подтвердили преимущества в отношении церулоплазмина шумовой модели над гипертермией (р=0,0167980, 7-й день; р=004813, 21-й день) и магнитным полем (р=0,000005 во все контрольные точки), в отношении витамина Е — над магнитным полем (р=0,000006, 21-й день).

Обсуждение и заключение. Учитывая совокупность фактов, включающих изменения компонентов прооксидантной/антиоксидантной системы при воздействии различных стресс-факторов, значимые преимущества в плане моделирования окислительного стресса установлены в модели шумового воздействия, превосходящие по степени индукции процессов ПОЛ модели гипертермии и магнитной нагрузки. Важно, что во все контрольные временные точки модель акустической нагрузки запускала в теплокровном организме каскад реакций, направленных на повышение интенсивности процессов пероксидации. Объяснением данному факту может служить определение мишеней для шумового воздействия: в единичных публикациях указано, что на биологические мембраны, и в частности на белки клеточных мембран, нацелено действие звуковых волн [17]. В результате воздействия шума меняются конформационно-функциональные свойства интегральных и поверхностных белков, что прежде всего сказывается на клеточной проницаемости и катионно-анионном дисбалансе со всеми вытекающими последствиями [18]. Важно учитывать в данных условиях развитие мембранной энзимопатии, сопутствующей увеличению интенсивности процессов свободнорадикального (перекисного) окисления липидов, являющихся ключевой структурой белково-липидного кластера биомембран. Как камень, падающий с вершины горы, повышение интенсивности вышеперечисленных реакций тянет за собой целый каскад процессов, связанных с перегрузкой эндогенных антиоксидантов. Именно поэтому истощается резерв эндогенной антиоксидантной системы, снижение активности основных компонентов которой было подтверждено настоящим исследованием.

Таким образом, моделирование окислительного стресса в организме лабораторных животных влиянием шума подтвердило свою эффективность, базирующуюся на выраженных изменениях параметров антиоксидантного статуса к концу первой, второй и третьей недель экспериментального воздействия. Проведенное исследование предполагает дальнейшее изучение влияния акустической нагрузки на адаптационный потенциал теплокровного организма с целью апробации потенциальных фармакокорректоров негативного воздействия шума.