Экспрессия vimentin, α-SMA и CD34 в злокачественных типах опухолей молочной железы у собак

Введение. В современной онкологии микроокружение опухоли молочной железы считается важным фактором, влияющим на формирование преметастатической ниши в метастазировании и реакции на недостаток питательных веществ, кислорода или терапевтические препараты [1][2]. В исследованиях [3–5] было установлено, что преобладающим компонентом стромы опухолей молочной железы являются CAFs — гетерогенная группа клеток, которая участвует в ряде процессов микроокружения, способствуя ремоделированию внеклеточного матрикса, отложению компонентов базальной мембраны, а также стимулирует ангиогенез, развитие, прогрессирование, инвазию и метастазирование рака. Данный пул клеток происходит из резидентных фибробластов, мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток, а также из эндотелиальных клеток (эндотелиально-мезенхимальный переход) и эпителиальных клеток (эпителиально-мезенхимальный переход) [3][4]. Было установлено, что виментин, α-SMA и CD34 являются потенциальными маркерами клеток фибробластического ряда (в т. ч. CAFs), с помощью которых можно определить наличие и локализацию данных клеток в опухоли молочной железы.

Виментин (vimentin) — это белок промежуточных филаментов, который имеет экспрессию в фибробластах, эндотелиальных клетках и является белком промежуточных филаментов. Белок регулирует миграцию, дифференцировку, пролиферацию, адгезию и инвазию клеток, а также модулирует эпителиально-мезенхимальный переход, который связан с возникновением и развитием опухолей [6].

α-SMA — одна из изоформ актина, стимулирует подвижность клеток, а также участвует в поддержании их формы, полярности и регулирует транскрипцию. Его экспрессия характерна для миофибробластов, известных как CAFs [7][8][9].

CD34 — это биомаркер гемопоэтических и негемопоэтических стволовых клеток, включающий сосудистые эндотелиальные клетки-предшественники, эмбриональные фибробласты, а также мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки [10][11].

В настоящее время экспрессия онкомаркерных белков стромы злокачественных опухолей молочной железы у животных изучена недостаточно. Однако некоторые исследования указывают на то, что в строме многих злокачественных инвазивных опухолей с низкой степенью дифференцировки CD34+ не обнаруживаются. Это связано с тем, что под воздействием растворимых факторов (особенно TGF-β), секретируемых опухолевыми клетками [12], они дифференцируются в α-SMA-миофибробласты, ассоциированные с раком [13][14].

Цель данного исследования — изучить экспрессию биомаркеров фибробластического

дифферона vimentin, α-SMA, CD34 в стромальном компоненте микроокружения злокачественных опухолей молочной железы у собак, чтобы определить их дифференцировку в CAFs.

Материалы и методы. Исследование проводилось в течение 2022–2024 гг. на базе Научно-диагностического и лечебно-ветеринарного центра, на кафедре паразитологии и ветсанэкспертизы, анатомии и патанатомии им. профессора С.Н. Никольского ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет» и ветеринарных клиник г. Ставрополя (ИП Шаламова Е.В. «Колибри», ИП Заиченко И.В. «Ветеринарный центр им. Пирогова»). Были проанализированы амбулаторные карты онкологических пациентов ветеринарных аналитических систем VetAIS, VetDesk и «Ветменеджер». Учитывали следующие аспекты нозологического профиля: пол, возраст, порода, ранняя проведенная кастрация, пораженная гряда молочных пакетов, рецидивы, а также инструментальные и лабораторные исследования на наличие патологических состояний, указывающих на наличие отдаленных метастазов.

Материал для настоящего исследования отбирали при унилатеральной/регионарной мастэктомии и биопсии опухолей молочной железы у самок собак (n=26). Для исследования были взяты кусочки размером 1 см³ на границе изменённых участков молочной железы и здоровой ткани и кожи, согласно рекомендациям руководства врачей-патологоанатомов «Макроскопическое исследование биопсийного и операционного материала». После фиксации в 10 %-ном забуференном формалине («БиоВитрум», Россия) в течение 48 ч была произведена проводка и заливка материала с получением парафиновых блоков и далее срезов толщиной 5 мкм с последующим монтированием их на предметное стекло с адгезивным покрытием PCI, со шлифованной кромкой, с колорированным краем (CITOTEST, Китай). Для определения локализации виментина применяли моноклональные кроличьи антитела Vimentin (SP20) 1:25-1:50 (Richard-Allan Scientific Co., США), α-SMA антитела моноклональные мышиные (Actin, Smooth Muscle Ab-1 (1A4) 1:25-1:50 (Richard-Allan Scientific Co., США), CD34 антитела моноклональные мышиные (134М 15) 1:50-1:200 (Cell Marque, США).

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием пероксидазы-полимерной системы визуализации по стандартному протоколу фирмы-производителя (Dako, США) с помощью демаскировки антител кипячением срезов при 100 ℃ в цитратном буфере (pH=6,0) в течение 10 мин с докрашиванием ядер клеток гематоксилином Майера («Биовитрум», Россия). Для негативного контроля использовали замену первых антител раствором для разведения (Spring Bioscience, США).

Микроскопические исследования полученных гистологических препаратов проводили на прямом световом микроскопе Olympus BX45 (Япония) со встроенной камерой фото- и видеофиксации С300 и программным обеспечением для микроскопической съёмки CellSensEntry (Япония). С каждого препарата делали по 10 цифровых снимков с учетом гистоархитектоники тканей для анализа гистологических структур при увеличении ×400, охватывающем HPF=0,44 мм² исследуемой ткани.

Для оценки экспрессии виментина, α-SMA и CD34 и прогностического значения данных маркеров использовали метод, предложенный Л.Е. Гуревич (2003):

— мембранный или нормальный тип экспрессии — равномерное распределение иммунореактивности по всей клеточной мембране;

— мембранно-редуцированный тип экспрессии — распределение иммунореактивности только на отдельных участках клеточной мембраны;

— смешанный мембранно-цитоплазматический тип экспрессии — равномерная цитоплазматическая экспрессия в сочетании с мембранной;

— мелко- и крупногранулярный цитоплазматический — экспрессия в виде гранул, рассеянных в цитоплазме клеток;

— комковатый — экспрессия в цитоплазме клеток виде хаотично локализованных крупных комочков и конгломератов иммунореактивного материала;

— отсутствие иммунореактивности.

Для оценки прогностического значения описанных типов экспрессии в клетках была проведена оценка иммунореактивности по Л.Е. Гуревич (2003):

— 0 баллов;

— мембранный тип — 1 балл;

— сочетание мембранного с гранулярно-цитоплазматическим — 2 балла;

— крупногранулярный — 3 балла.

Дополнительно проводили оценку интенсивности экспрессии иммунореактивного материала визуально, с учетом процента активных клеток, суммы площади иммунопозитивных структур согласно рекомендациям Американского общества клинической онкологии/Колледжа американских патологов (ASCO/CAP, 2018 г.):

1. Иммунореактивность положительная (ИГХ 3+), если наблюдается периферическое мембранное полное интенсивное окрашивание более 10 % опухолевых клеток.
2. Иммунореактивность неопределенная (ИГХ 2+), если наблюдается от слабой до умеренной интенсивности, полное мембранное окрашивание более 10 % опухолевых клеток.
3. Иммунореактивность отрицательная (ИГХ 1+), если наблюдается неполное, слабое/едва заметное мембранное окрашивание более 10 % опухолевых клеток.
4. Иммунореактивность отрицательная (ИГХ 0), если не наблюдается окрашивание или отмечается неполное, слабое/едва заметное мембранное окрашивание 10 % или менее опухолевых клеток.

Результаты исследования. Предварительно было проведено рутинное патогистологическое исследование на 26 образцах опухолей молочной железы, согласно которому основным гистологическим типом является солидная карцинома G3 (таблица 1). Данные по возрасту представлены в таблице 2. Весь материал поступил от самок, две из которых были кастрированы. Анализ выявил, что наибольшая распространенность новообразований наблюдалась у собак мелких пород — 42,31 % от всех случаев; средних и беспородных — по 15,385 % соответственно; крупных — 26,92 %. Опухоль молочной железы поражала как левую гряду (2-й молочный пакет — 3,16 % от общего количества; 5-й молочный пакет — 15,79 %), так и правую гряду (3-й и 5-й молочные пакеты — по 13,16 % соответственно, 4-й пакет — 21,05 %). Метастазирование в паховые лимфатические узлы зафиксировано в 30,77 % от всех случаев. Среди 26 пациентов был выявлен один случай рецидива.

Экспрессия виментина в опухолях молочной железы у собак показана на рис. 1.

Иммунореактивный материал расположен в цитоплазме равномерно в виде крупных темно-коричневых зерен (3 балла), однако в некоторых клетках встречался перинуклеарно в виде отдельных крупных фокусов возле ядра. Иммунопозитивные участки занимали ≥50 % от общей площади материала, экспрессия биомаркера была сильная (+++). Клетки, экспрессирующие виментин, имели фибробластический тип — отросчатой формы с вытянутым ядром. В опухолях молочной железы они визуализировались в виде густой сети как в междольковом, так и во внутридольковом компоненте стромы, окружая в большом количестве паренхиму, что отражает, по нашему мнению, их паракринное влияние, направленное на развитие опухоли молочной железы.

Высокая экспрессия альфа-гладкомышечного актина α-SMAв опухолях молочной железы у собак показана на рис. 2. Темно-коричневый иммунореактивный материал в папиллярных, солидных и тубулярных карциномах имел перинуклеарное расположение, в смешанных опухолях — равномерное по всей цитоплазме клетки (3 балла). Иммунопозитивные участки занимали ≥50 % от общей площади материала, экспрессия биомаркера сильная (+++). Клетки с фибробластическим фенотипом — отросчатой формы с вытянутым ядром, находились в виде тяжей в междольковом и во внутридольковом компоненте стромы. Экспрессия маркера CD34 в опухолях молочной железы у собак показана на рис. 3. Иммунопозитивные клетки в небольшом количестве были локализованы по рассыпному типу, регистрировались в междольковом компоненте стромы опухоли. Экспрессия их участков неполная, едва заметная, цитоплазматическое окрашивание более 10 % опухолевых клеток, отрицательное (+). Клетки имели округлую или вытянутую форму, ядро повторяло форму клетки. Иммунореактивный материал был равномерно расположен в цитоплазме, имел мелко- и крупногранулярную темно-коричневую структуру (3 балла). Чаще клетки визуализировались в тех местах, где стромальный компонент подвергался фиброзу и склерозу.

Обсуждение и заключение. Согласно проведенному исследованию, во всех новообразованиях отмечалась высокая экспрессия виментина и α-SMA. Что касается маркера CD34, то его экспрессия в высокодифференцированных опухолях (G1) была низкая, а в низкодифференцированных неоплазиях (G3) — вообще отсутствовала. Потеря экспрессии данного маркера произошла вследствие дифференцировки клеток в миофибробласты стромальной ниши опухоли молочной железы у собак. Наши данные подтверждают результаты исследований [12][13][14], свидетельствующие о том, что в ходе развития и дифференцировки злокачественных опухолей молочной железы происходит потеря экспрессии CD34 и усиление экспрессии α-SMA.

Таким образом, иммуногистохимическое исследование показало, что при различных типах новообразований молочной железы у собак имеется клеточная линия с определенным биомаркерным фенотипом, указывающим на их принадлежность к CAFs. Полученные нами данные можно использовать в качестве фундаментальных прикладных данных при изучении канцерогенеза в ветеринарной онкологии.