Комплексный анализ цитотоксичности генетически модифицированного штамма Lactobacillus plantarum 8РАЗ (B-11007) с выявлением и оценкой факторов вирулентности

Введение. Активное развитие биотехнологий и методов генной инженерии расширяет возможности конструирования пробиотических штаммов с заданными функциональными характеристиками, при этом идентификация и аннотирование потенциальных факторов вирулентности осуществляется с использованием специализированных баз данных и классификационных схем [1]. Современные представления о роли пробиотиков в поддержании здоровья человека и регуляции метаболических процессов подтверждают перспективность направленной модификации бактерий с целью усиления их полезных свойств [2]. В то же время результаты фенотипического и геномного анализа штаммов Lactobacillus reuteri демонстрируют необходимость комплексной оценки безопасности даже для традиционно используемых пробиотиков [3]. Аналогичные данные о важности сопоставления геномных маркеров и фенотипических характеристик при оценке безопасности данного штамма приведены в [3]. Обобщающие обзоры подчеркивают, что расширение спектра пробиотических продуктов требует строгого контроля их биологической безопасности и отсутствия патогенного потенциала [4].

Комплексный подход к оценке безопасности пробиотических культур, включающий генотипический и фенотипический анализ, реализован при исследовании Lacticaseibacillus paracasei NTU 101, что демонстрирует актуальность многоуровневой проверки новых штаммов [5]. Сходные методологические принципы применяются при анализе Lactobacillus bulgaricus IDCC 3601, где оцениваются потенциальные риски для человека [6]. Детальная характеристика фенотипических и генотипических свойств Levilactobacillus brevis KU15006 также подтверждает необходимость исключения факторов вирулентности и антибиотикорезистентности [7]. Известно, что молекулярные сигнальные пути, регулирующие пролиферацию и выживание клеток в условиях воспалительного стресса, могут модифицироваться под воздействием микробных факторов, что подчеркивает значимость изучения клеточных механизмов ответа хозяина [8].

Проблема безопасности генетически модифицированных микроорганизмов особенно актуальна для ветеринарной практики, где пробиотики используются для нормализации микробиоценоза и повышения устойчивости животных к инфекциям, что подтверждается исследованиями Lactococcus lactis IDCC 2301 [9]. Оценка четырех штаммов лактобацилл с пробиотическими свойствами показала, что даже близкородственные микроорганизмы требуют индивидуального анализа генетической стабильности и отсутствия нежелательных детерминант [10]. Существенное значение имеет активность ферментов, таких как гидролазы желчных солей, которые находятся на пересечении взаимодействия микробиоты и организма хозяина [11]. Исследования штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CKDB001 подтверждают необходимость оценки не только безопасности, но и функциональных метаболических эффектов [12].

Экспериментальные модели in vitro широко применяются для оценки цитотоксичности и безопасности инкапсулированных пробиотических культур, что продемонстрировано для Lactiplantibacillus plantarum CRD7 и Lacticaseibacillus rhamnosus CRD11 [13]. Изменения кишечной микробиоты и метаболических показателей после введения Lacticaseibacillus paracasei AO356 подтверждают важность изучения системного эффекта пробиотиков [14]. Анализ фенотипических и генотипических свойств Weissellacibaria JW15 также свидетельствует о необходимости всесторонней оценки безопасности новых культур [15]. Дополнительным этапом предклинической проверки является in silico-анализ потенциальных генов вирулентности и резистентности, как показано для представителей рода Bacillus, выделенных из пчелиной продукции [16].

Отдельное внимание уделяется способности штаммов продуцировать биогенные амины, которые могут оказывать токсическое действие при накоплении в пищевых продуктах, что продемонстрировано для молочнокислых бактерий, выделенных из рыбной продукции [17]. Геномное секвенирование и оценка пробиотического потенциала штаммов Lacticaseibacillus paracasei LC86 и Lacticaseibacillus casei LC89 подтверждают значимость комплексного анализа их безопасности [18]. Обзоры, посвященные биогенным аминам в ферментированных продуктах, подчеркивают возможные риски для здоровья при неконтролируемой микробной активности [19]. Современные данные о микробиоме ротовой полости и его влиянии на системное здоровье также указывают на необходимость строгой оценки пробиотических вмешательств [20].

Экспериментальные исследования на модели инфекции Clostridioides difficile демонстрируют, что пробиотические штаммы могут снижать выраженность воспаления и восстанавливать барьерную функцию кишечника, что подтверждает их терапевтический потенциал при условии доказанной безопасности [21]. Однако даже условно-патогенные штаммы лактобацилл при определенных условиях способны проявлять цитопатическое действие на кишечный эпителий. В этой связи комплексный анализ цитотоксичности представляет собой необходимый этап доклинических исследований новых штаммов-пробиотиков.

Цель работы — провести комплексный анализ цитотоксических свойств генетически модифицированного штамма Lactobacillus plantarum 8РАЗ (B-11007), направленный на идентификацию и характеристику факторов вирулентности, детерминирующих индукцию клеточной смерти и дисфункцию клеточных механизмов.

Материалы и методы. Экспериментальная часть работы выполнена в условиях Геномного центра Северо-Кавказского Федерального университета (г. Ставрополь) и бактериологической лаборатории базовой кафедры эпизоотологии и микробиологии Ставропольского государственного аграрного университета в период с 23 января по 17 февраля 2026 г.

В рамках настоящей работы штамм Lactobacillus plantarum 8РАЗ (B-11007) был генетически модифицирован путём введения рекомбинантной плазмиды, включающей функционально независимые экспрессионные кассеты, кодирующие гетерологичные белки под контролем конститутивных промоторов.¹ Оценку цитотоксичности генетически модифицированного штамма L. plantarum 8РАЗ (B-11007) проводили в соответствии с авторской методикой А.В. Фролова «Способ определения цитотоксичности бактерий»².

Для проведения исследования использовали генетически-модифицированный штамм L. plantarum 8РАЗ (B-11007) и его нативный аналог в качестве контроля. Такой подход позволяет не только выявить различия в цитопатическом эффекте между ГМ-формой и контролем, но и оценить сохранение или усиление полезных свойств штамма, что критически важно для объективной оценки безопасности модифицированного штамма и функциональной активности.

Бактериальные штаммы культивировали на стандартной питательной среде MRS (Difco™) в анаэробных условиях при температуре 37 °C с использованием газопакетов AnaeroGen (Oxoid, Великобритания). Приготовление бактериальной суспензии проводили в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS), оптическую плотность доводили до 0,5 по стандарту МакФарланда, что соответствовало концентрации приблизительно 1,5×10⁸ КОЕ/мл, с последующим разведением до рабочей концентрации 1×10⁹ КОЕ/мл.

Оценку цитотоксичности проводили с использованием двух параллельных подходов. На первом этапе органную культуру тощей кишки клинически здоровых 10-суточных телят (n=10) помещали в стерильные контейнеры над покровным стеклом с жидкой питательной средой (RPMI-1640), содержащей суспензию исследуемого штамма Lactobacillus в конечной концентрации 1×10⁹ КОЕ/мл. Инкубацию с бактериальной суспензией проводили в течение 30 мин при 37 °C в атмосфере 5 % CO₂ и 95 % влажности с использованием CO₂-инкубатора (Binder GmbH, Германия). После воздействия контейнеры центрифугировали на скорости 10 000 об/мин в течение 10 мин для седиментации, отслоившихся в результате цитопатического эффекта клеток. Каждый эксперимент был выполнен в 5-ти биологических повторностях.

Параллельно проводили оценку цитотоксичности на первичной культуре энтероцитов, выделенных из тощей кишки 10-суточных телят. Клетки высевали в 96-луночные планшеты, покрытые коллагеном I типа, плотностью 3×10⁴ клеток на лунку и культивировали в среде RPMI-1640 с 10 % эмбриональной сывороткой теленка до формирования монослоя. Для оценки цитотоксичности использовали МТТ-тест с инкубацией в течение 24 ч и последующим измерением оптической плотности при 570 нм. Целостность кишечного барьера оценивали путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления с помощью вольт/омметра EVOM2, регистрируя показания каждые 4 ч в течение 24 ч.

Для определения механизмов цитотоксичности проводили флуоресцентную микроскопию с окрашиванием аннексином V-FITC и пропидиум йодидом для дифференциации апоптоза и некроза. Дополнительно оценивали активность каспаз 3/7 с использованием набора Caspase-Glo 3/7 Assay.

Количественную оценку цитотоксичности (С) проводили по формуле:

С= N/t (1- g1/g0), (1)

где N — количество отслоившихся при центрифугировании клеток, подсчитанных на 1,96 мм² по диагоналям покровного стекла;

g0 — ускорение центробежной силы отслоения клеток, не обработанных цитотоксической суспензией бактерий;

g1 — ускорение центробежной силы отслоения клеток, обработанных цитотоксической суспензией бактерий;

t — время воздействия цитотоксической суспензии бактерий, ч.

Для более детальной оценки влияния на клеточные функции был применен МТТ-тест на монослое первичных энтероцитов в течение 24 ч. Тест основан на восстановлении тетразолиевого красителя MTT митохондриальными дегидрогеназами живых клеток. Процент жизнеспособности клеток (VC, Viability Cell) рассчитывали по формуле:

VC (%) = (OD570 опыта / OD570 контроля) × 100 %, (2)

где OD570 опыта — оптическая плотность раствора формазана в лунках с клетками, обработанными бактериями;

OD570 контроля — оптическая плотность в лунках с клетками, культивируемыми в чистой питательной среде.

Все полученные численные данные были подвергнуты статистической обработке. Результаты выражены как среднее арифметическое (M) ± стандартное отклонение (SD) или стандартная ошибка среднего (SEM). Для проверки нормальности распределения данных использовали критерий Шапиро-Уилка. Сравнение средних значений между экспериментальной и контрольными группами проводили с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок в программе Primer of Biostatistics 4.03 (McGraw-Hill, США). Различия считались статистически значимыми при уровне p≤0,05.

Результаты исследования. Первичная оценка потенциального цитотоксического действия генетически модифицированного штамма L. plantarum 8РАЗ (B-11007), проведенная в соответствии с методикой А.В. Фролова на органной культуре тощей кишки, выявила отсутствие статистически значимого увеличения цитотоксичности между воздействием ГМ-штамма и его нативного аналога (таблица 1).

Как следует из данных таблицы 1, индекс цитотоксичности ГМ-штамма не имел статистически значимых отличий (p>0,05) от показателя контрольного нативного штамма. Количество отслоившихся клеток в обеих группах (соответствующее индексу цитотоксичности в диапазоне 0,06–0,12 у. е.) находилось в пределах референсных значений, установленных для данной органной культуры в условиях отсутствия патогенного воздействия (0,05–0,15 у. е.). Это свидетельствует об отсутствии цитопатического действия и нарушения адгезивных свойств ткани под воздействием генетически модифицированного штамма даже в условиях экстремального стресс-теста. Важно подчеркнуть, что методика основана на кратковременном (30 мин) воздействии чрезвычайно высокой концентрации бактерий (1×10⁹ КОЕ/мл) с последующим применением центробежной силы, что моделирует предел устойчивости ткани. Данные условия являются стрессовыми и экстремальными, моделирующими не стандартное взаимодействие, а скорее «предел устойчивости» ткани. В контексте оценки безопасности выявление эффекта в таких условиях является ценным индикатором для дальнейших, более глубоких исследований, но не может быть прямым свидетельством патогенности in vivo, где концентрации бактерий и условия взаимодействия существенно мягче.

Визуальная оценка органных культур после проведения эксперимента подтвердила полученные количественные данные. Слизистая оболочка тощей кишки в обеих опытных группах (как при воздействии нативного, так и ГМ-штамма) сохраняла характерные морфологические признаки, соответствующие норме. Поверхность образцов имела равномерный бледно-розовый цвет, что свидетельствует о сохраненной микроциркуляции и отсутствии признаков ишемии или геморрагических поражений. При макроскопическом исследовании отмечалась гладкая, влажная поверхность слизистой, характерная для здоровой ткани. Отсутствие участков помутнения, очаговой гиперемии, отека или массивного слущивания эпителия дополнительно свидетельствует об отсутствии деструктивного воздействия со стороны ГМ-штамма.

Результаты МТТ-теста на монослое первичных энтероцитов показали, что через 24 ч инкубации метаболическая активность клеток, обработанных ГМ-штаммом, статистически значимо превышала таковую в группе контроля (таблица 2).

Полученные данные из таблицы 2 свидетельствуют о том, что ГМ-штамм обладает умеренным стимулирующим действием на метаболическую активность энтероцитов, статистически значимо (p<0,05) повышая её на 8,7 % по сравнению с контрольным штаммом. Этот эффект может быть связан с направленным изменением метаболизма бактерии в результате генетической модификации, например с усиленной выработкой специфических метаболитов (короткоцепочечных жирных кислот, витаминов группы B), оказывающих трофическое действие на клетки кишечного эпителия.

Для оценки безопасности на уровне регуляции клеточной гибели был проведен анализ апоптоза и активности исполнительных каспаз 3/7 (таблица 3).

Как следует из данных таблицы 3, ГМ-штамм достоверно (p<0,05) снижает долю клеток в раннем апоптозе на 31 % по сравнению с контролем, при этом не влияя на активность каспаз 3/7 (p>0,05). Это указывает на антиапоптотический эффект, не связанный с классическим каспаз-зависимым путем, и подтверждает безопасность штамма.

Все полученные количественные данные, демонстрирующие баланс между безопасностью и полезными свойствами ГМ-штамма, сведены в таблице 4.

Обсуждение и заключение. На основании проведенного комплекса исследований установлено, что генетически модифицированный штамм L. plantarum 8РАЗ (B-11007) не проявляет цитотоксического действия на органную культуру кишечника телят. Индекс цитотоксичности ГМ-штамма (0,09±0,03 у. е.) статистически значимо не отличался (p>0,05) от показателя нативного штамма-предшественника (0,08±0,02 у. е.) и находился в пределах физиологической нормы, что свидетельствует о сохранении клеточной адгезии и целостности гистологической структуры ткани. Макроскопическая оценка слизистой оболочки показала сохранение нормальных характеристик — бледно-розового цвета и типичного рельефа поверхности с физиологическими шероховатостями, что дополнительно подтверждает отсутствие патологических изменений тканей.

Показано, что ГМ-штамм обладает положительным влиянием на функциональную активность энтероцитов. Выявлено статистически значимое (p<0,05) повышение метаболической активности клеток на 8,7 % по сравнению с контролем, а также достоверное усиление барьерной функции, выражающееся в увеличении трансэпителиального электрического сопротивления на 15,2 % к 24 часу ко-инкубации. Подтверждено, что механизм взаимодействия ГМ-штамма с клетками хозяина не связан с индукцией апоптоза или некроза. В опытной группе зафиксировано статистически значимое снижение доли клеток в раннем апоптозе (3,1 % против 4,5 % в контроле; p<0,05) при фоновом уровне активности каспаз 3/7, что указывает на безопасность штамма на уровне регуляции клеточной гибели.

Проведенные исследования позволяют заключить, что генетическая модификация штамма L. plantarum 8РАЗ (B-11007) не привела к приобретению им цитопатических свойств или факторов вирулентности. Сохранение нормальных макроскопических характеристик слизистой оболочки кишечника в сочетании с положительным влиянием на клеточные функции свидетельствуют о наличии у ГМ-штамма позитивных эффектов, выражающихся в стимуляции метаболизма энтероцитов и укреплении кишечного эпителиального барьера. Выявленные свойства делают данный штамм перспективным кандидатом для разработки на его основе новых пробиотических препаратов. Для полного понимания механизмов наблюдаемого положительного действия и идентификации конкретных бактериальных метаболитов, ответственных за выявленные эффекты, целесообразно проведение дальнейших протеомных и метаболомных исследований. Полученные результаты являются основанием для перехода к следующему этапу доклинических испытаний на лабораторных животных.