Содержание
Перейти к:
Морфологическое исследование культуры Brucella suis при разных условиях низкотемпературного хранения
https://doi.org/10.23947/2949-4826-2025-24-1-31-38
EDN: KLCQIP
Аннотация
Введение. Бруцеллез — опасное зоонозное заболевание, опосредованно и напрямую передающееся от животных человеку. Несоблюдение ветеринарных требований и правил при содержании животных и реализации продукции животноводства может привести к возникновению стойко неблагополучной по бруцеллезу эпизоотической ситуации, предотвратить которую можно своевременным проведением вакцинации. На эффективность вакцины могут влиять различные факторы, в первую очередь — свойства вакцинного штамма, которые могут измениться в результате неблагоприятных условий (например, длительного хранения). Для нивелирования деструктивного воздействия заморозки бактериальные клетки помещают в различные среды, в таком случае важно подтвердить сохранение структур бактериальных клеток на морфологическом уровне. Однако до сих пор нет комплексных морфологических исследований влияния различных режимов низкотемпературного хранения на ультраструктуру Brucella suis. Цель данного исследования — провести морфологический анализ бактерий Brucella suis (штамм 22) для оценки специфичности влияния глубокой заморозки в различных условиях на его ультраструктуру.
Материалы и методы. Исследование проведено в 2024 г. на базе ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). В качестве объекта исследований брали суспензии клеток Brucella suis (штамм 22), выращенных в разных условиях, проводили дегидратацию и заливку в эпоксидные смолы с последующей полимеризацией. Для ультраструктурного анализа образцы подготавливали по методике ультратонких срезов, монтировали на бленды, контрастировали и просматривали на просвечивающем электронном микроскопе. Статистическую обработку результатов исследования осуществляли в программах Statistica 6.0 и MS Excel с использованием теста Манна–Уитни, с исходным уровнем значимости α=0,05 и последующей коррекцией уровня значимости по методу Бонферрони (до α=0,002).
Результаты исследования. При оценке воздействия глубокой заморозки на ультраструктуру бактерий Brucella suis (штамм 22), выращенных в обезжиренном молоке и сахарозо-желатиновой среде, морфологических отличий от нативного штамма не обнаружено. Статистически значимые отличия от нативного штамма выявлены лишь в группе с применением лиофильной сушки, однако и эти отличия лежат в пределах стандартного отклонения.
Обсуждение и заключение. По результатам проведенного морфологического исследования воздействия глубокой заморозки на ультраструктуру бактерий Brucella suis (штамм 22) можно сделать вывод о предпочтительности низкотемпературного хранения в обезжиренном молоке и сахарозо-желатиновой среде. В будущем планируется исследование особенностей воздействия других условий хранения на ультраструктуру бактерий рода Brucella для пополнения данных в паспортах штаммов. Данная работа имеет важное практическое значение для организации коллекций микроорганизмов и разработки диагностических средств.
Ключевые слова
зооантропонозы,
Brucella suis,
вакцина,
глубокая заморозка,
низкотемпературное хранение,
морфологический анализ,
морфометрические показатели,
ультраструктура бактерий
Для цитирования:
Саитов В.Р., Юсупова К.В., Кашеваров Г.С., Панкова Е.В. Морфологическое исследование культуры Brucella suis при разных условиях низкотемпературного хранения. Ветеринарная патология. 2025;24(1):31-38. https://doi.org/10.23947/2949-4826-2025-24-1-31-38. EDN: KLCQIP
For citation:
Saitov V.R., Yusupova K.V., Kashevarov G.S., Pankova E.V. Morphological Study of the Culture of Brucella Suis under Different Low-Temperature Storage Conditions. Russian Journal of Veterinary Pathology. 2025;24(1):31-38. (In Russ.) https://doi.org/10.23947/2949-4826-2025-24-1-31-38. EDN: KLCQIP
Введение. Одним из глобальных вызовов современности являются зооантропонозы — инфекционные заболевания, передающиеся опосредованно и напрямую от животных человеку. На данный момент известно более 200 видов зоонозных инфекций, и их список постоянно пополняется. Важной проблемой для ветеринарии и медицины на территории Российской Федерации остается заболеваемость людей и животных бруцеллезом, который может проявиться в виде паралича, менингоэнцефалита, нейросенсорной глухоты и др., в зависимости от типа бактерии, ставшей причиной развития бруцеллеза [1–10]. По данным ряда исследователей эпизоотолого-эпидемиологической обстановки, на начало 2021 г. в России зарегистрированы 234 неблагополучных пункта по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота, а также зафиксированы случаи заболевания людей [11]. Причинами возникновения стойкой неблагополучной по бруцеллезу эпизоотической ситуации могут стать: несоблюдение ветеринарных требований и правил при содержании животных и реализации продукции животноводства, несвоевременный убой больных животных, невыявленные эпизоотические очаги и скрытые носители бруцелл.
Основными патогенными видами рода Brucella, способными вызывать серьезные эпизоотические и эпидемические осложнения, являются B. melitensis, B. abortus и B. suis [12]. Важнейшим инструментом в изучении морфологических особенностей бактериальных клеток является электронная микроскопия [13][14]. Так, исследования ряда авторов касаются ультраструктурных особенностей L-форм бруцелл [15][16]. Казахские ученые методом негативного контрастирования изучали S- и R-формы изолятов бруцелл [17]. Сотрудники ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) более 10 лет проводят исследования ультраструктурных особенностей бруцелл, включая воздействие на данные микроорганизмы факторов различной этиологии [18–21].
Действенным средством для предотвращения заболевания является вакцинация [22–25]. Однако на эффективность вакцины могут влиять различные факторы: условия производства, транспортировки, способ ее введения, но особенно — условия хранения. Выделяют следующие этапы подготовки вакцины: получение посевных культур, процесс накопления биомассы, розлив, заморозка, сублимационное высушивание (лиофилизация), герметизация и упаковка. Лиофилизация является оптимальным методом для длительного хранения культур, но этот этап экономически эффективен и безопасен только для производства инактивированных вакцин. Процесс лиофилизации вирулентных штаммов намного сложнее ввиду больших экономических затрат и трудоемкости, поэтому для длительного хранения живых культур зачастую используют глубокую заморозку. Чтобы нивелировать деструктивное воздействие заморозки на бактериальные клетки, их помещают в различные среды, однако в таком случае важно подтвердить сохранность их структур на морфологическом уровне. К сожалению, до сих пор не существует комплексных исследований влияния различных режимов глубокого замораживания на ультраструктуру Brucella suis с использованием современных методов морфологического анализа. Большинство существующих работ исследуют только выживаемость бактерий, что не подтверждается на ультраструктурном уровне. Цель данного исследования — провести морфологический анализ Brucella suis (штамм 22) для оценки влияния низкотемпературного хранения в различных условиях на ультраструктуру бактерий.
Материалы и методы. Исследование проведено в 2024 г. на базе лаборатории морфологических исследований и отдела Государственной коллекции штаммов микроорганизмов Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань). В качестве объекта исследований брали суспензии клеток Brucella suis (штамм 22), выращенных после хранения в разных условиях: 1 группа — нативный; 2 группа — лиофилизированный; 3 группа — в обезжиренном молоке при –40 °C; 4 группа — в обезжиренном молоке при –70 °C; 5 группа — в сахарозо-желатиновой смеси при –40 °C; 6 группа — в сахарозо-желатиновой смеси при –70 °C.
Обработка проб осуществлялась по разработанной авторами схеме: суспензии бактериальных клеток центрифугировали, осадок культуры трижды промывали, затем фиксировали в пробирках типа эппендорф раствором 2,5 % глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере. После двукратной промывки фосфатным буфером той же молярности проводили постфиксацию тетраоксидом осмия, дегидратацию в спиртах возрастающей концентрации, ацетоне и импрегнацию образцов смесью эпоновых смол с последующей полимеризацией [25].
Для ультраструктурного анализа образцы подготавливали по методике ультратонких срезов с помощью микротома LKB-III (Швеция). Полученные срезы монтировали на блендах с подложкой из пиолоформа, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, а после сушки просматривали на просвечивающем электронном микроскопе JEM 1100 (JEOL, Япония), масштабная линейка 200 нм. Полученные электронограммы подвергали морфометрическому анализу в программе ImageJ (сборка FIJI, США).
Статистическую обработку результатов осуществляли в программах Statistica 6.0 (США) и MS Excel. Попарное сравнение результатов, полученных на нативном штамме и штаммах, хранившихся в различных условиях, проводилось с использованием теста Манна–Уитни с исходным уровнем значимости α=0,05 и последующей коррекцией уровня значимости по методу Бонферрони (до α=0,002).
Результаты исследования. На электронограммах ультратонких срезов бактерии Brucella suis (штамм 22) всех групп округлые и палочкообразные (в зависимости от угла прошедшего среза), с четкими, немного волнистыми границами. Отмечается наличие единичных клеток неправильной формы с расширенным периплазматическим пространством, что можно связать с естественными процессами. Изредка просматриваются увеличенные клетки округлой формы и бактериальные клетки в процессе деления (рис. 1–3).
Рис. 1. Электронограмма B. suis штамм 22 (в том числе наблюдается в процессе деления), масштабная линейка 200 нм
Рис. 2. Электронограмма B. suis штамм 22 (в том числе клетка неправильной формы), масштабная линейка 200 нм
Рис. 3. Электронограмма B. suis штамм 22 (в том числе клетка резко увеличенного размера), масштабная линейка 200 нм
Результаты морфометрических исследований приведены в таблице 1.
Таблица 1
Морфометрические показатели B. suis (штамм 22) после различных условий хранения
Группа | Площадь | Периметр | Большой калиперо-метрический диаметр | Малый калиперо-метрический диаметр | Коэффициент округлости |
1. Нативный | 0,22±0,09 | 1,76±0,46 | 0,66±0,21 | 0,42±0,06 | 0,87±0,1 |
2. Лиофилизированный | 0,21±0,09 | 1,77±0,51 | 0,7±0,25 | 0,38±0,06* | 0,83±0,11 |
3. Обезжиренное молоко (-40 °C) | 0,21±0,09 | 1,75±0,47 | 0,67±0,21 | 0,39±0,08 | 0,85±0,1 |
4. Обезжиренное молоко (-70 °C) | 0,22±0,07 | 1,76±0,4 | 0,68±0,18 | 0,4±0,06 | 0,87±0,1 |
5. Сахарозо-желатиновая смесь (-40 °C) | 0,24±0,09 | 1,89±0,47 | 0,74±0,22 | 0,39±0,06 | 0,82±0,11 |
6. Сахарозо-желатиновая смесь (-70 °C) | 0,23±0,17 | 1,79±0,82 | 0,69±0,37 | 0,41±0,08 | 0,88±0,11 |
Примечание: * — статистически значимые отличия в сравнении с нативной группой (р<0,05)
Результаты исследований показали статистически значимые отличия (в сравнении с группой 1) по малому калиперометрическому диаметру в группе с применением лиофильной сушки, однако поскольку данные различия лежат в пределах стандартного отклонения средней величины показателя, следует охарактеризовать их как тенденцию. Параметры остальных групп не имели статистически значимых отличий от показателей нативной группы.
Обсуждение и заключение. По результатам оценки воздействия глубокой заморозки на ультраструктуру бактерий Brucella suis (штамм 22), выращенных в обезжиренном молоке и сахарозо-желатиновой среде, морфологических отличий от нативного штамма не обнаружено, что позволяет сделать вывод о предпочтительности хранения в данных средах. Некоторые отличия от нативного штамма зарегистрированы в группе с применением лиофильной сушки, но и они лежат в пределах стандартного отклонения средней величины показателя. В перспективе планируется исследование особенностей воздействия других сред хранения на ультраструктуру бактерий рода Brucella для пополнения данных в паспортах штаммов. Эта работа имеет также важное практическое значение для организации коллекций микроорганизмов и разработки диагностических средств.
Список литературы
1. Аксенова П.В. Болезни зубров (Bison bonasus): встречаемость и эпизоотические особенности заболеваний зубров. Ветеринарная патология. 2014;(2):51–63.
2. Аракелян П.К., Трегубов А.Н., Руденко А.В., Ильин Е.Н., Христенко Н.В., Вергун А.А., и др. Противоэпидемическая значимость контроля эпизоотического процесса бруцеллеза. В: Материалы региональной научнопрактической конференции с международным участием, посвященной 70-летию со дня основания ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора «Проблемы особо опасных инфекций на Северном Кавказе». Ставрополь: ООО "Экспо-Медиа"; 2022. 69–70.
3. Микаилов М.М., Юсупов О.Ю., Халиков А.А., Яникова Э.А., Кабахова П.М., Шехилалиева Г.М., и др. Об эпизоотической ситуации по бруцеллезу животных в республике Дагестан и мерах по ее стабилизации. Ветеринарная патология. 2019;(3(69)):5–11. https://doi.org/10.25690/VETPAT.2019.69.39587
4. Насибуллин Р.Ю., Тухватуллина Л.А., Богова Я.А., Сафина Г.М., Косарев М.А. Бруцеллез: его распространение и профилактика. Ветеринарный врач. 2021;(1):38–43. https://doi.org/10.33632/1998-698Х.2021-1-38-44
5. Косарев М.А., Фомин А.М., Сафина Г.М., Григорьева С.А., Тухватуллина Л.А. Дифференциальная серологическая диагностика бруцеллеза у крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, и ее значение в общей системе мер борьбы с данным заболеванием. Ветеринарный врач. 2019;(5):23–28. https://doi.org/10.33632/1998-698X.2019-5-23-28
6. Косарев М.А., Богова Я.А., Сафина Г.М., Тухватуллина Л.А. Остаточная вирулентность, антигенные свойства, длительность приживаемости и контагиозность штамма B. abortus 82-TR. Вестник КрасГАУ. 2023;(1(190)):131–135. https://doi.org/10.36718/1819-4036-2023-1-131-135
7. Косарев М.А., Насибуллин Р.Ю., Сафина Г.М., Богова Я.А., Саитов В.Р. Приживаемость и иммуногенность r-культуры бруцелл, полученной глубинным культивированием. Ветеринарный врач. 2024;(1):40–45. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_1_40
8. Laine CC, Scott HM, Arenas-Gamboa AM. Human brucellosis: Widespread Information Deficiency Hinders an Understanding of Global Disease Frequency. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2022;16(5):e0010404. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0010404
9. O’Callaghan D. Human brucellosis: recent advances and future challenges. Infectious Diseases of Poverty. 2020;9:101. https://doi:10.1186/s40249-020-00715-1
10. Qureshi KA, Parvez A, Fahmy NA, Hady BHA, Kumar S, Ganguly A, et al. Brucellosis: Epidemiology, Pathogenesis, Diagnosis and Treatment – A Comprehensive Review. Annals of Medicine. 2023;55(2):2295398. https://doi.org/10.1080/07853890.2023.2295398
11. Пономаренко Д.Г., Скударева О.Н., Хачатурова А.А., Лукашевич Д.Е., Жаринова И.В., Даурова А.В. и др. Бруцеллез: тенденции развития ситуации в мире и прогноз на 2022 г. в Российской Федерации. Проблемы особо опасных инфекций. 2022;(2):36–45. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2022-2-36-45
12. Bonaventura GD, Angeletti S, Ianni A, Petitti T, Gherardi G. Microbiological Laboratory Diagnosis of Human Brucellosis: An Overview. Pathogens. 2021;10(12):1623. https://doi.org/10.3390/pathogens10121623.
13. Авакян А.А. Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных. Акад. мед. наук СССР. Москва: Медицина; 1972. 183 с.
14. Диденко Л.В. Ультраструктурный анализ как метод изучения бактериемии при инфекционных заболеваниях. Вестник Российской академии медицинских наук. 2001;(11):29–34.
15. Таран И.Ф., Цыбин Б.П., Крылова A.A. Изучение L-форм бруцелл, их ревертантов и исходных культур. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1981;(6):39–43.
16. Базиков И.А., Бондаренко А.И. Ультраструктурная организация L-форм бруцелл и ревертантных культур. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1981;(6):39–43.
17. Сансызбай А.Р., Еспембетов Б.А., Зайцевидр В.Л. Изучение морфологических свойств изолятов бруцелл в S- и R-формах электронно-микроскопическим методом. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2013;(12(110)):74–79.
18. Сальникова М.М., Саитов В.Р., Сафина Г.М., Рахматуллин И.Ф., Косарев М.А., Фомин А.М. Изучение ультратонкого строения живых и инактивированных культур Brucella melitensis и Brucella abortus. Достижения науки и техники АПК. 2012;(3):80–82.
19. Сальникова М.М., Малютина Л.В., Саитов В.Р., Голубев А.И. Трансмиссионная электронная микроскопия в биологии и медицине. Монография. Казань: Издательство Казанского университета; 2016. 125 с.
20. Сальникова М.М., Саитов В.Р., Баймухаметов Ф.З., Косарев М.А., Фомин А.М., Сафина Г.М. Электронномикроскопические исследования морфологических особенностей бруцелл. В: Материалы VI-й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельского хозяйства горных территорий». ГорноАлтайск: Горно-Алтайский государственный университет; 2017. С. 260–263.
21. Косарев М.А., Сальникова М.М., Кашеваров Г.С., Никитина А.А., Баймухаметов Ф.З., Саитов В.Р. Особенности ультраструктурной организации бактерий Brucella melitensis при воздействии гамма-лучей: морфометрический аспект. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2022;(9(215)):76–83. https://doi.org/10.53083/1996-4277-2022-215-9-76-83
22. Балахонов С.В., Дубровина В.И., Войткова В.В., Корытов К.М., Баранникова Н.Л., Николаев В.Б. и др. Иммунофенотипирование клеток крови экспериментальных животных, иммунизированных термоэкстрактами Brucella abortus. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;4(96):25–31. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-4-25-31
23. Димов С.К., Димова А.С., Аракелян П.К. Современные проблемы управления эпизоотическим процессом бруцеллеза. В: Материалы XIV Сибирской ветеринарной конференции. Актуальные вопросы ветеринарной конференции. Новосибирск: Издательский центр Новосибирского государственного аграрного университета "Золотой колос"; 2015. С. 28–31.
24. Онищенко Г.Г., Куличенко А.Н., Малецкая О.В., Пономаренко Д.Г., Манин Е.А., Ковалев Д.А. и др. Бруцеллез. Современное состояние проблемы. Монография. Ставрополь: Общество с ограниченной ответственностью "Губерния"; 2019. 336 с.
25. Саитов В.Р., Сальникова М.М., Голубев А.И., Кашеваров Г.С., Иванов В.В., Малютина Л.В. и др. Изменения ультраструктуры паренхимы печени и почек животных после хронического воздействия ксенобиотиков. Монография. Казань: Издательство Казанского университета; 2023. 108 с.
Об авторах
В. Р. Саитов
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности
Россия
Россия
Вадим Расимович Саитов, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории морфологических исследований
420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
К. В. Юсупова
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности
Россия
Россия
Ксения Витальевна Юсупова, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник лаборатории морфологических исследований
420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
Г. С. Кашеваров
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности
Россия
Россия
Глеб Сергеевич Кашеваров, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией морфологических исследований, старший научный сотрудник
420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
Е. В. Панкова
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности
Россия
Россия
Екатерина Витальевна Панкова, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела Государственной коллекции микроорганизмов
420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
Исследование, посвященное оценке влияния глубокой заморозки на ультраструктуру бактерий Brucella suis, показало, что при хранении в обезжиренном молоке морфологические изменения не обнаружены. Однако при применении лиофильной сушки выявлены незначительные отличия, что подтверждает предпочтительность низкотемпературного хранения в этих условиях. Это имеет важное практическое значение для организации коллекций микроорганизмов и разработки диагностических средств, а также обосновывает необходимость дальнейшего исследования влияния различных условий хранения на морфологию штаммов Brucella.
Рецензия
Для цитирования:
Саитов В.Р., Юсупова К.В., Кашеваров Г.С., Панкова Е.В. Морфологическое исследование культуры Brucella suis при разных условиях низкотемпературного хранения. Ветеринарная патология. 2025;24(1):31-38. https://doi.org/10.23947/2949-4826-2025-24-1-31-38. EDN: KLCQIP
For citation:
Saitov V.R., Yusupova K.V., Kashevarov G.S., Pankova E.V. Morphological Study of the Culture of Brucella Suis under Different Low-Temperature Storage Conditions. Russian Journal of Veterinary Pathology. 2025;24(1):31-38. (In Russ.) https://doi.org/10.23947/2949-4826-2025-24-1-31-38. EDN: KLCQIP
Просмотров:
201
Послать статью по эл. почте 