Доклинические испытания усовершенствованной «Ассоциированной вакцины против ИРТ, ВД-БС, ПГ-3 и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» на белых мышах и кроликах

Введение. Инфекционные респираторные и кишечные болезни молодняка крупного рогатого скота (КРС) представляют собой серьезную проблему для животноводческих хозяйств по всей России. В этиологии патологий участвуют, как правило, несколько возбудителей одновременно, представляющие собой устойчивые ассоциации вирусных и бактериальных агентов,
вызывающие различные по проявлению и тяжести течения заболевания [1–3]. Борьба с респираторно-кишечными ассоциированными инфекциями КРС ведется в животноводческой отрасли в подавляющем большинстве стран мира [3–5]. Немаловажным фактором, обуславливающим необходимость усовершенствования способов этой борьбы, а также профилактики
респираторно-кишечных инфекций, является экономическая сторона вопроса: животноводческие комплексы несут огромные финансовые потери в связи с широким распространением ассоциированных инфекций среди поголовья [6, 7].

Возбудители вирусных заболеваний обычно вызывают первичную инфекцию, которая сначала протекает в легкой форме: на этом этапе происходит подавление иммунитета, что впоследствии приводит к повышению восприимчивости к вторичным бактериальным инфекциям [6, 8–10]. Однако в некоторых случаях алгоритм развития инфекционного процесса протекает иначе и в качестве патогена, вызвавшего первичную инфекцию, выступают бактерии, как правило, те, которые способны к длительному персистированию в инфицированном организме, не вызывая при этом ярко выраженных клинических признаков инфекции, например, хламидии [11].

Хламидии — облигатные внутриклеточные паразиты с уникальным двухэтапным циклом развития [12]. Эти микроорганизмы способны инфицировать огромное количество видов животных. Течение инфекционного процесса при хламидиозе даже в разных популяциях одного вида животных обычно не имеет системы [13], что обусловлено эволюционной способностью данного вида микроорганизмов поражать разнообразные системы органов животных, вызывая при этом различные клинические признаки болезни (пневмонии, артриты, конъюнктивиты, энцефалиты и др.). Помимо этого, хламидии способны передаваться от одного вида животных другому, что также играет важную роль в широком распространении этой инфекции среди домашних и диких животных [3, 14].

Наиболее распространенными вирусными патогенами на территории РФ являются возбудители таких инфекций, как инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3) и вирусная диарея (ВД-БС) [15, 16]. Ранее коллективом ученых Федерального центра токсикологической, радиологической и биологической безопасности (г. Казань) была разработана «Ассоциированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, болезни слизистых, парагриппа-3 и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» [16]. Антигенный состав этого биопрепарата включал в себя по одному штамму вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС и штамм Chlamydia psittaci «250», выделенный от КРС.

Многолетние прикладные и фундаментальные исследования хламидийных инфекций животных позволили установить, что разные штаммы хламидий одного вида, выделенные при разных патологиях от одного и того же вида животных или от других сельскохозяйственных животных, отличаются друг от друга в антигенном отношении. Эти различия в биохимическом и генетическом строении хламидий напрямую коррелируют с иммуногенностью разных штаммов по отношению друг к другу [17]. Также установлен факт наличия у хламидий способности к горизонтальному переносу генов среди разных видов этого возбудителя, благодаря чему некоторые штаммы хламидий в своем биохимическом составе могут содержать некоторые антигенные эпитопы, специфичные для других видов этого патогена [18].

Ранее нами были изучены антигенные и иммуногенные свойства разных штаммов хламидий, выделенных на территориях различных субъектов РФ [17, 19, 20]. В ходе исследований нами была сконструирована новая антигенная композиция, состоящая из трех наиболее иммуногенных и отличающихся в антигенном отношении штаммов хламидий, выделенных от разных видов животных. Помимо этого, после полногеномного секвенирования и последующего биоинформационного анализа нуклеотидной последовательности хромосомы одного из штаммов, входящих в новую антигенную композицию, было установлено, что этот штамм содержит антигенные эпитопы, специфичные сразу к двум видам хламидий — Chlamydia psittaci и Chlamydia abortus [21]. В связи с этим, перспективно было применить в составе ассоциированной вакцины новую композицию хламидийного антигена, включающую три штамма хламидий, что и было сделано.

Таким образом, в состав «Ассоциированной вакцины против ИРТ, ВД-БС, ПГ-3 и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» были включены антигены еще двух штаммов хламидий — «АМК-16» (возбудитель артрита и аборта коз) и «МЗ-89» (возбудитель менингоэнцефалита телят). При этом количественное соотношение антигенов разных видов возбудителей в составе вакцины осталось прежним. Доклинические испытания на лабораторных животных имели целью выяснить, как повлияло изменение композиции хламидийного антигена на свойства «Ассоциированной вакцины против ИРТ, ВД-БС, ПГ-3 и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной».

Материалы и методы. Исследование проводили на базе лаборатории вирусных заболеваний животных ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) в период с февраля по ноябрь 2024 г.

Штаммы. Использовались следующие штаммы вирусов и хламидий:

– штамм «ВК-1» вируса ВД-БС, инфекционный титр 10^-6,87ТЦД₅₀/ ml;

– вакцинный штамм «ТК-А (ВИЭВ)-В-2» вируса ИРТ крупного рогатого скота;

– референтный штамм «ПТК-45/86» вируса ПГ-3 крупного рогатого скота;

– штамм Chlamydia psittaci «АМК-16», выделенный из патологического материала абортировавшей козы;

– штамм Chlamydia psittaci «250», выделенный из патологического материала абортировавшей коровы;

– штамм Chlamydia psittaci «МЗ-89», выделенный из мозга теленка при энцефалитной форме течения хламидийной инфекции;

– штамм Chlamydia psittaci «РС-85», выделенный из патологического материала абортировавшей свиньи.

Питательные среды. Стерильность биопрепаратов оценивали путем их высева на питательные среды: мясопептонный агар (МПА); мясопептонный бульон (МПБ); мясопептонный печеночный бульон и среду Сабуро. Для культивирования и поддержания культуры клеток использовались следующие питательные среды: синтетическая среда 199; сбалансированный раствор Хэнкса; эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота, изготовленная ВНИВИ; среда Игла МЕМ (Minimum Essential Medium) с глутамином, рН 7,5–7,6.

Культуры клеток. Культивирование вирусов осуществляли на перевиваемой культуре клеток почки быка «MDBK».

Биологические модели. Биомассу хламидий получали путем заражения куриных эмбрионов штаммами хламидий в желточный мешок.

Лабораторные животные. Белые мыши и кролики.

В ходе проведения экспериментальных манипуляций с животными были соблюдены требования Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях. Животные содержались в оптимальных условиях, имели свободный доступ к кормам и воде.

Реактивы и тест-системы. Серологические исследования проводили с применением следующих диагностических тест-систем:

– «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» (РОСС RU.ФВ01.Н00022) производства ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань);

– «Набор для диагностики парагриппа-3 крупного рогатого скота» (ФКП «Курская биофабрика – Фирма «БИОК»);

– «Набор для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом «ИРТ-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим», г. Москва);

– «Набор для иммуноферментной диагностики вирусной диареи – болезни слизистых (ВД-БС) крупного рогатого скота» (ВИЭВ, г. Москва).

Состав вакцин. Для проведения исследования были изготовлены два различных по антигенному составу варианта ассоциированной вакцины. Первая (стандартная) серия биопрепарата включала в себя штаммы
вирусов: ПГ-3 — «ПТК-45/86», ВД-БС — «ВК-1»,
ИРТ — «ТК-А (ВИЭВ)-В-2» и хламидий — «250». При изготовлении второй (экспериментальной) серии вакцины использовались аналогичные штаммы вирусов, а в состав хламидийного антигена были добавлены еще два штамма — «АМК-16» и «МЗ-89». Количество антигенов всех штаммов в хламидийном антигене находились в равных пропорциях. В готовых обоих вариантах вакцины антигены вирусов и хламидий были представлены в равном соотношении: ПГ-3, ИРТ, ВД-БС и хламидии в пропорции 1:1:1:1. В качестве вспомогательного компонента при создании каждой серии вакцины использовали масло-ланолиновый адъювант (МЛА). Эмульсия вакцины представляла собой систему вода-масло.

Методы. Определение стерильности вакцин проводили в соответствии с «ОФС 1.2.4.0003.15 Общая фармакопейная статья. Стерильность» (п. 2.3) методом прямого посева.

Определение безвредности экспериментальных препаратов проводили в соответствии с ГОСТ 31926. Для каждой серии вакцины были сформированы группы по 15 белых мышей в возрасте от 2 до 3 месяцев с живой массой от 18 до 25 г. Подготовленные пробы исследуемых препаратов вводили животным внутрибрюшинно, в объеме 0,25 см³. Далее, на протяжении 10 суток после введения вакцины, проводили ежедневные клинические осмотры привитых животных с целью выявления больных или павших особей. Вакцина считалась безвредной, если на протяжении всего срока наблюдения за животными у них не выявляли ухудшение общего состояния или не фиксировали случаи гибели.

Для оценки переносимости и антигенной активности вакцин 12 кроликов были разделены на три группы по 4 особи в каждой. Первую группу животных иммунизировали стандартной серией вакцины, вторую — экспериментальной. Животные третьей группы вакцинации не подвергались и являлись контролем. Биопрепараты животным вводили внутримышечно в область бедра в объеме 0,5 см³.

При оценке переносимости вакцин кроликами учитывали следующие показатели:

– общее состояние животных;

– общая температура тела после иммунизации;

– наличие местной реакции на месте введения вакцины;

– изменения аппетита после иммунизации;

– поведенческие реакции.

Оценка переносимости вакцин проводилась в течение первых 10 суток после иммунизации. Ежедневно, в ходе проведения клинических осмотров животных, фиксировались и учитывались вышеперечисленные показатели. Общая температура тела измерялась при помощи медицинского ртутного термометра. Общее состояние оценивали визуально, основное внимание обращали на позы животных, их шерстный покров
и походку. Об аппетите животных судили по наличию или отсутствию корма в кормушках после кормления. О переносимости вакцин судили по отсутствию местной и общей реакции животных на введение биопрепарата.

Оценку антигенной активности вакцин проводили при помощи серологических реакций. Для этого у исследуемых животных систематически в течение 6 месяцев (на 30-е, 60-е, 90-е и 180-е сутки после вакцинации) отбирались пробы сывороток крови. Концентрация антител, специфичных к вирусу ПГ-3, определялась в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Уровень противохламидийных антител в сыворотках крови иммунизированных животных определяли путем постановки реакции связывания комплемента (РСК). Специфические антитела к вирусам ИРТ и ВД-БС определялись при помощи иммуноферментного анализа (ИФА).

Способность вакцин вызывать выработку противохламидийного иммунитета у иммунизированных животных определяли в остром опыте на белых мышах (n=180). Для каждой серии вакцины были сформированы по четыре опытные (всего 8 опытных групп) и четыре контрольные группы лабораторных животных по 15 особей в каждой. Животным опытных групп вводили исследуемые препараты подкожно в объеме 0,2 см³. На 30-е сутки после иммунизации животные всех групп были заражены различными штаммами хламидий. Первые опытные группы мышей заражали штаммом «АМК-16», вторые — «РС-85», третьи — «250», четвертые — «МЗ-89». Контрольные группы были инфицированы аналогичным способом.

Об иммуногенности биопрепаратов судили по индексу защиты, который вычисляли по формуле:

(1)

где Х — индекс защиты; А — количество павших животных в контрольных группах; В — количество павших животных в иммунизированных группах.

Для подтверждения хламидийной этиологии гибели инфицированных мышей проводили исследование мазков-отпечатков под иммерсионной системой светового микроскопа (Nikon Eclipse, Япония). Мазки-отпечатки готовили из внутренних органов павших животных и окрашивали по модифицированному методу Стемпа.

Результаты исследования. Высевом проб двух вакцин (усовершенствованной и стандартной) на питательные среды МПА, МПБ, МППБ и Сабуро было установлено отсутствие роста микрофлоры на питательных средах в течение срока наблюдения, что подтверждало стерильность исследуемых препаратов.

Введение экспериментального и стандартного образцов вакцин белым мышам не вызвало у них никаких побочных реакций и негативных патологических процессов в течение срока наблюдений, что указывало на безвредность препаратов.

 Наблюдения за иммунизированными и интактными кроликами в ходе изучения переносимости вакцин показали, что на протяжении всего срока исследования средняя температура тела животных двух опытных, вакцинированных разными вариантами ассоциированной вакцины, и контрольной групп практически не изменялась и находилась в пределах от плюс 38,8 ºС до плюс 39,0 ºС. Все изучаемые показатели находились в пределах физиологической нормы.

При проведении ежедневных клинических осмотров иммунизированных кроликов патологических состояний выявлено не было. Общее состояние животных было удовлетворительным, аппетит сохранен, аномальные поведенческие реакции отсутствовали. На месте введения биопрепаратов у животных опытных групп наблюдалась небольшая припухлость, которая рассасывалась в течение 10–15 суток после прививки, что допустимо при иммунизации эмульсионными вакцинами.

Для определения влияния на формирование поствакцинального гуморального иммунитета были проведены серологические исследования, в ходе которых установлен уровень специфических антител к антигенам, использованным в составе экспериментальной и стандартной вакцин, в крови кроликов в разные сроки после иммунизации. Результаты серологических исследований представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что вакцинация кроликов обоими вариантами биопрепаратов вызвала у них выработку как противовирусных, так и противохламидийных антител. На 30-е сутки после вакцинации уровень иммуноглобулинов, специфичных к вирусу парагриппа-3 у животных, иммунизированных стандартным препаратом, варьировался в пределах титров от 1:80 до 1:320. У всех кроликов, иммунизированных экспериментальным препаратом, на этот срок исследования титры антител к вирусу ПГ-3 были равны 1:160. Средние титры иммуноглобулинов к вирусу ПГ-3 в двух группах были равны титру 1:160. Концентрация противовирусных антител, специфичных к вирусу инфекционного ринотрахеита, в двух группах на 30-е сутки исследования находилась в пределах титров от 1:400 до 1:1600.

Также не было выявлено значительной разницы в формировании гуморального иммунитета к вирусу ВД-БС. На 30-е сутки исследования иммуноглобулины, специфичные к этому вирусу, находились в пределах титров от 1:800 до 1:1600. Небольшая разница была выявлена на 30-е сутки после вакцинации при формировании гуморального противохламидийного иммунитета. В группе, иммунизированной стандартным препаратом, у всех животных концентрация комплементсвязывающих иммуноглобулинов находилась на уровне, равном титру 1:20. В группе животных, иммунизированных экспериментальным препаратом, средний титр антител был несколько выше и равнялся титру 1:30.

Следует отметить, что самая низкая концентрация как противовирусных, так и противохламидийных иммуноглобулинов, была выявлена на 30-е сутки после вакцинации. В течение двух последующих месяцев в сыворотках крови иммунизированных животных наблюдали увеличение концентрации антител, специфичных ко всем антигенам, входящим в состав ассоциированной вакцины. Так, на 90-е сутки к вирусу ПГ-3 в РТГА были установлены средние титры антител на уровне 1:1440 и 1:1600 к стандартному и экспериментальному вариантам вакцины соответственно. Средние титры специфических антител к вирусу ИРТ в ИФА в этот промежуток времени находились в пределах титров 1:5600 для стандартного образца вакцины и 1:5200 для экспериментального. К вирусу ВД-БС на 90-е сутки после вакцинации средние титры противовирусных антител в обеих группах равнялись титру 1:3600.

Несколько иная картина наблюдалась при исследовании сывороток крови с хламидийным антигеном, где была выявлена существенная разница между уровнем антител в двух группах вакцинированных кроликов. Так, средний титр антител в РСК с хламидийным
антигеном в группе животных, вакцинированных стандартным образцом биопрепарата, был равен 1:60, в то время как в группе лабораторных животных, иммунизированных экспериментальным препаратом, средний титр был выше и составил 1:100. Следует отметить, что такая картина наблюдалась и в другие сроки исследования, на 60-е и 180-е сутки.

К 180-м суткам концентрация противовирусных и противохламидийных антител в сыворотках крови иммунизированных животных начала снижаться в обеих группах, но всё равно в экспериментальной группе она была выше. При этом существенная разница между уровнем антител к специфическим антигенам по группам не выявлялась за исключением хламидийного антигена, к которому более высокий уровень антител выявлялся в группе животных, вакцинированных экспериментальным вариантом.

На рис. 1, 2, 3 и 4 представлена динамика средних титров специфических антител к вирусным и хламидийным антигенам в течение всего срока наблюдений за животными (для наглядности — отдельно по каждому антигену).

Представленные данные (рис. 1, 2, 3 и 4) свидетельствуют о том, что изменение состава хламидийного антигена в ассоциированной вакцине не оказало негативного влияния на формирование гуморального противовирусного иммунитета, но позволило повысить выработку специфических противохламидийных антител в сыворотках крови иммунизированных животных.

Для определения влияния на иммуногенность усовершенствованной вакцины был проведен острый опыт на лабораторных белых мышах. Первую и вторую группы животных иммунизировали модифицированной вакциной и стандартным образцом соответственно. Далее проводили заражение всех групп животных четырьмя производственными штаммами хламидий. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, из 60 мышей, иммунизированных стандартной вакциной, после заражения четырьмя штаммами хламидий выжило 46 особей. Индексы защиты в группах белых мышей после инфицирования возбудителями хламидиоза находились в пределах показателей от 3,5 до 4,7. Средний индекс защиты по четырем группам белых мышей, вакцинированных стандартным препаратом, был равен 4.

В группах мышей, иммунизированных усовершенствованной ассоциированной вакциной, количество выживших животных было значительно выше (51 особь). Индексы защиты при заражении разными штаммами хламидий находились в пределах показателей от 4,7 до 7,5. Средний индекс защиты по всем группам, зараженным разными штаммами хламидий и вакцинированных усовершенствованным препаратом, был равен 6,2, что в 1,3 раза выше по сравнению со стандартным образцом.

В контрольных группах после заражения вирулентной культурой хламидий разных штаммов в живых осталось только 4 (6,7 %) из 60 белых мышей.

Обсуждение и заключение. Данные, полученные в ходе доклинических испытаний усовершенствованной «Ассоциированной вакцины против ИРТ, ВД-БС, ПГ-3 и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной», позволяют утверждать, что она переносится лабораторными животными так же хорошо, как и стандартная. Изменение состава хламидийного антигена препарата не оказывает негативного эффекта на формирование гуморального противовирусного иммунитета у лабораторных животных, напротив, добавление в состав вакцины двух штаммов хламидий стимулирует выработку гуморального ответа в отношении хламидийного антигена и в 1,3 раза повышает иммуногенность вакцины по сравнению со стандартным образцом.