Модель крыс с нокаутом гена DAT: дофаминовая дисфункция, эпигенетические механизмы и подходы к генной терапии. Обзор научной литературы

Введение. Крысы и мыши с нокаутом гена Slc6a3, кодирующего белок-транспортер дофамина (DAT), представляют собой ценную экспериментальную модель DAT-KO для изучения патофизиологии заболеваний, связанных с нарушением дофаминовой регуляции. Дофаминовый транспортер играет ключевую роль в регуляции дофаминергической нейропередачи, обеспечивая обратный захват дофамина из синаптической щели в пресинаптические нейроны, что контролирует интенсивность и продолжительность сигналов на дофаминовых рецепторах [1][2]. DAT экспрессируется преимущественно в дофаминергических нейронах черной субстанции и вентральной тегментальной области, с наибольшей плотностью в полосатом теле и прилежащем ядре, где он регулирует до 80 % дофаминовой сигнализации [1]. В префронтальной коре, критической для высшего когнитивного контроля и социальных взаимодействий, DAT совместно с норадреналиновым транспортером модулирует дофаминовую активность, влияя на социальное поведение [2][3]. Нарушения гомеостаза дофамина, опосредованного DAT, связаны с депрессией, биполярным расстройством, синдромом дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ), шизофренией, болезнью Паркинсона. Так как DAT служит мишенью для психостимуляторов, таких как кокаин и метилфенидат, он связан с расстройствами, связанными с употреблением психоактивных веществ [1][4].

Модель животных DAT-KO характеризуется полным отсутствием функционального белка, что вызывает гипердофаминергическое состояние с 5–7-кратным увеличением внеклеточного дофамина и снижением его пресинаптических запасов [5]. Это приводит к гиперактивности, моторным стереотипиям, когнитивным дефицитам и нарушениям мотивации, а также к нейроанатомическим изменениям, включая уменьшение объема полосатого тела, увеличение объема префронтальной коры и мозжечка, снижение плотности ГАМКергических интернейронов и нарушения в серотонинергической системе [2][4][6]. Физиологически у крыс DAT-KO наблюдаются снижение веса тела и нарушения моторной координации, что делает модель релевантной для изучения СДВГ и шизофрении [1][2]. Гетерозиготные крысы DAT-KO с частичным снижением активности DAT также проявляют измененные формы поведения. Поэтому даже частичная утрата функции DAT способна вызывать значимые нейрохимические и поведенческие изменения [6].

Цель обзора — систематизация научных данных о дофаминовой дисрегуляции, эпигенетических механизмах и подходах к генной терапии на модели крыс с нокаутом гена DAT (DAT-KO).

Материалы и методы. Поиск литературы проводился в базах данных PubMed, Scopus, Web of Science и Google Scholar с использованием ключевых слов: dopamine transporter, DAT-KO, SLC6A3, dopamine dysregulation, epigenetic regulation, gene therapy, dopamine signaling, DAT knockout rats, DAT knockout mice, neurotransmitter transporters. Последний поиск выполнен 5 октября 2025 года. В анализ включались оригинальные исследования, обзоры и мета-анализы только на английском языке, опубликованные в период с 1991 по 2025 гг. В выборку вошли публикации (n=49), содержащие данные о: дофаминовой дисфункции (нейрохимические и поведенческие фенотипы) в моделях DAT-KO у крыс; эпигенетических механизмах регуляции дофаминового транспортера; подходах к генной терапии дефицита DAT с использованием вирусных векторов. Результаты систематизированы и представлены в виде блок-схемы PRISMA и рисунков.

Результаты исследования.

Отбор источников. В результате поиска, проведенного во всех базах данных и в других источниках, было выявлено 253 работы. После удаления 43 дубликатов для дальнейшего анализа отобрано 210 статей. По результатам проверки заголовков и аннотаций исключено 115 источников. Потенциально подходящие полные тексты (n=95) загружены в облачное хранилище и изучены всеми экспертами для оценки актуальности. На этом этапе исключены еще 46 публикаций, не содержащих информации о методологии, результатах или их интерпретации в контексте дофаминергической дисфункции. Таким образом, для включения в обзор окончательно отобрано 49 статей. Краткое изложение процесса проверки представлено на блок-схеме PRISMA (рис. 1).

Ген SLC6A3 и его роль в дофаминовой дисфункции. Ген SLC6A3, кодирующий DAT, относится к семейству Na⁺- и Cl⁻-зависимых переносчиков нейромедиаторов (рис. 2). У человека он локализован на хромосоме 5p15.33 и занимает около 52,5 тыс. п.н., включая 15 кодирующих экзонов [7][8]. Белок DAT состоит из 620 аминокислот, имеет молекулярную массу около 69 кДа и включает 12 трансмембранных доменов. N- и C-концевые участки белка ориентированы в цитоплазму, а между третьим и четвертым доменами располагается крупная внеклеточная петля с сайтами N-гликозилирования [9].

У мыши ген Slc6a3 локализован на хромосоме 13, его структура высококонсервативна: ген также состоит из 15 экзонов, а границы интрон-экзонных соединений в кодирующих областях полностью совпадают с человеческими [10]. Размер мышиного гена заметно меньше — около 24,5 тыс. п.н., а нуклеотидная идентичность кодирующих последовательностей с человеческим DAT составляет 85 % (93 % на уровне аминокислот). При этом у мыши отсутствует крупный VNTR-повтор в 3'-нетранслируемой области, характерный для человека, а полноразмерная мРНК короче на 10 % [10][11].

Крысиный ген Slc6a3 также содержит 15 экзонов, а его кДНК была клонирована и секвенирована еще в начале 1990-х гг. [12][13]. Аминокислотная последовательность крысиного DAT демонстрирует 97 % идентичности с человеческим белком в пределах трансмембранных доменов и 87 % — во внемембранных регионах [11]. Крысиный белок, как и мышиный, состоит из 619 аминокислот (на одну меньше, чем у человека, за счет отсутствия кодона CAG, кодирующего глицин в позиции 198) и имеет молекулярную массу около 69 кДа [11].

Основная функция DAT заключается в Na⁺- и Cl⁻-зависимом обратном захвате дофамина из синаптической щели в пресинаптическое окончание (рис. 3). С меньшей эффективностью он способен переносить норадреналин [15][16]. Наибольшая экспрессия наблюдается в дофаминергических нейронах черной субстанции и вентральной области покрышки [1], при этом наибольшая плотность белка отмечается в аксональных терминалях полосатого тела и прилежащего ядра [17][18]. В префронтальной коре количество DAT существенно ниже, и его функции частично компенсируются норадреналиновым переносчиком [19].

Функциональная активность белка регулируется посттрансляционными модификациями. Фосфорилирование сериновых остатков в С-концевой области влияет на внутриклеточный транспорт и скорость обратного захвата дофамина [20]. Пальмитоилирование цистеинов во втором и пятом трансмембранных доменах способствует образованию олигомеров [21]. Убиквитинирование лизинов в С-конце определяет скорость деградации белка [22], а N-гликозилирование аспарагинов внеклеточной петли стабилизирует структуру DAT и регулирует его экспрессию на мембране [23].

Генетические варианты SLC6A3 включают полиморфизм в виде 40 п.о. VNTR в 3'-нетранслируемой области. Число повторов может варьировать от трех до одиннадцати, при этом наиболее распространенной является аллель с десятью повторами, встречающаяся примерно у 70 % населения [24][25]. Более короткие варианты, например аллель 9R, ассоциированы с повышенным риском шизофрении, а также с формированием зависимости от кокаина и алкоголя. Аллель 10R, напротив, чаще связывают с болезнью Паркинсона и СДВГ, а также меньшей предрасположенностью к никотиновой зависимости [8].

Наряду с этим описаны патогенные мутации, включая миссенс-замены (например, p.Leu368Gln) и нарушения сплайсинга (c.1269+1G→A), которые приводят к развитию синдрома дефицита DAT, также известного как детский паркинсонизм-дистония 1 [26]. Для этого состояния характерна полная утрата функции белка и выраженная гипердофаминергия [26][27]. Оценка толерантности гена к повреждениям (GDI=0,90) указывает на его умеренную чувствительность к мутациям [28]. Среди известных белковых партнеров DAT описаны PRKCABP и TGFB1I1 [29], участвующие в регуляции фосфорилирования; SYNGR3, связывающийся с N-концевым участком [30]; и TOR1A, влияющий на внутриклеточную локализацию [31].

Модели животных с нокаутом кодирующего гена DAT. Гомология между человеческим SLC6A3 и его крысиным ортологом высока. Кодирующая последовательность совпадает примерно на 85 % по нуклеотидам, а аминокислотная последовательность DAT — на 92 % [32]. Такая близость обеспечивает сохранение ключевых структурных и функциональных свойств белка у разных видов. Благодаря этому нокаут гена у крыс воспроизводит основные проявления дефицита DAT, характерные для человека, включая гипердофаминергию и нарушения моторного поведения. Следовательно, линия крыс DAT-KO представляет собой надежную модель для изучения патогенетических механизмов, связанных с дисфункцией DAT.

Изучение физиологической роли DAT началось с создания первых моделей животных с выключением соответствующего гена. Одной из первых подобных моделей стали мыши с нокаутом DAT, полученные методом гомологичной рекомбинации in vivo. Для построения таргетирующего вектора использовали кДНК DAT: участок длиной 2,0 кб, включающий экзоны 6–8, заменили кассетой PGK-Neo. Вектор вводили в эмбриональные стволовые клетки методом электропорации, а гомологичные рекомбинанты отбирали двойной селекцией и подтверждали саузерн-блоттингом. Эмбриональные клетки с корректной интеграцией использовали для получения химерных особей, от которых выведены линии гетерозиготных DAT^+/– и гомозиготных DAT^−/− мышей — первой экспериментальной модели дефицита DAT [33].

Нокаут крысиного Slc6a3 был реализован с помощью целевого мутагенеза. Впервые такую модель получили в 2018 г., используя линию Wistar-Han и метод «цинковых пальцев». Удаление пяти пар нуклеотидов во втором экзоне вызвало преждевременное образование стоп-кодона и отсутствие мРНК DAT в полосатом теле [5].

В 2022 г. была создана альтернативная линия Sprague-Dawley с идентичной мутацией, полученной методом CRISPR/Cas9. У гомозиготных животных белок полностью отсутствует, внеклеточный уровень дофамина увеличен в 5–7 раз, а в черной субстанции отмечено повышение экспрессии тирозингидроксилазы при сохранении нормальной регуляции других генов дофаминовой системы [34]. Гетерозиготные животные сохраняют около половины активности DAT и демонстрируют промежуточные поведенческие фенотипы [35].

Эпигенетические механизмы регуляции гена дофаминового транспортера. Экспрессия регулируется эпигенетическими механизмами, к которым относятся метилирование ДНК, модификации гистонов и действие некодирующих РНК [36]. Эти процессы определяют уровень транскрипции в дофаминергических нейронах и тем самым влияют на обратный захват дофамина и эндоцитоз DAT. Нарушения таких механизмов, вероятно, являются одним из факторов патогенеза нейродегенеративных и психических заболеваний.

Метилирование ДНК осуществляется ферментами ДНК-метилтрансферазами и обычно снижает активность промотора за счет включения 5-метилцитозина в CpG-острова [37]. В мозге пациентов с болезнью Паркинсона отмечено гиперметилирование промотора гена SLC6A3, что ведет к уменьшению экспрессии DAT и снижению эффективности его эндоцитоза, усиливая дефицит дофамина. Использование деметилирующих агентов, например 5-аза-2'-дезоксицитидина, способствует восстановлению экспрессии и стимулирует дифференцировку дофаминергических нейронов [36]. В норме у крыс промотор DAT в раннем постнатальном развитии остается гипометилированным, что обеспечивает возрастное повышение уровня мРНК в среднем мозге и отражает динамику созревания дофаминергической системы [38].

Модификации гистонов также регулируют доступность ДНК для транскрипционных факторов. Ацетилирование остатков H3K9/K14 значительно усиливается к 56-му постнатальному дню, что сопровождается ростом уровня мРНК DAT в среднем мозге и полосатом теле. Снижение экспрессии Dnmt1 на 71,3 % и Dnmt3a на 84,3 % к 56-му постнатальному дню сопровождается увеличением уровня DAT. В этот же период транскрипционные факторы Nurr1 и Pitx3 усиливают связывание с промоторной областью гена, причем активность возрастает в 6 и 8 раз соответственно. Эти взаимодействия с эпигенетическими маркерами обеспечивают возрастную регуляцию экспрессии DAT [38]. Гистондеацетилазы HDAC1 и HDAC2 подавляют транскрипцию, тогда как их ингибиторы, например вориностат, увеличивают степень ацетилирования и усиливают эндоцитоз белка [36]. Метилирование H3K27 под действием фермента EZH2 ингибирует экспрессию DAT в условиях болезни Паркинсона и снижает уровень генов, участвующих в эндоцитозе, таких как клатрин и динамин. Изменения в уровнях метилирования гистонов H3K4 и H3K27 при этом заболевании связаны с активацией нейровоспаления и гибелью нейронов [39].

МикроРНК и длинные некодирующие РНК посттранскрипционно регулируют экспрессию DAT. Дополнительным уровнем контроля служат модификации мРНК, такие как N6-метиладенин. Эти модификации определяют стабильность и эффективность трансляции мРНК, а также влияют на эндоцитоз через сигнальные пути, опосредованные протеинкиназой С и дофаминовыми рецепторами D2-типа [36][40]. Деметилазы снижают экспрессию DAT и способствуют накоплению α-синуклеина при болезни Паркинсона. Кроме того, редактирование РНК ферментами ADAR и псевдоуридилирование влияют на работу белков эндоцитоза и, как следствие, на процессы обратного захвата дофамина [36].

Нарушение данных механизмов, вероятно, связано с СДВГ, шизофренией и болезнью Паркинсона. При этом эпигенетические ингибиторы, например GSK126 и STM2457, по некоторым данным [36][41][42], могут рассматриваться как потенциальные терапевтические средства.

Методы генной терапии дефицита DAT. Исследования методов генной терапии дефицита DAT начались относительно недавно. Терапия основана на введении функциональной копии гена SLC6A3 с использованием вирусных векторов — в большинстве, аденоассоциированных вирусов (AAV) и лентивирусов (LV) [26].

Введение AAV2 или AAV9 с промотором синапсина в область черной субстанции или интравентрикулярно обеспечивает экспрессию человеческого DAT в дофаминергических нейронах с последующим транспортом белка в полосатое тело. В экспериментах на мышах DAT-KO терапия демонстрировала четкую дозозависимость: введение 2×10¹⁰ vg на мышь обеспечивало полное восстановление двигательных функций, нормализацию времени спуска по вертикальному шесту и других показателей двигательной активности, а также 100 % выживаемости к 12-й неделе. Подобные результаты были получены и после введения AAV9 на нулевой постнатальный день. Однако превышение терапевтической дозы на порядок вызывало токсичность с тремором и брадикинезией у половины животных [43].

У взрослых мышей применение AAV2 или AAV2/10 с различными конструкциями (hSyn1-hDAT, TH-iCre/CMV-DIO-mDAT) также приводило к дозозависимому восстановлению: наблюдалась нормализация дистанции перемещения и времени в центральной зоне в открытом поле, улучшение моторных навыков в тесте вертикального шеста, восстановление параметров походки и снижение гиперлокомоции [44].

Комбинированные подходы генной терапии дефицита DAT предполагают использование нескольких векторов для обеспечения селективной экспрессии в дофаминергических нейронах или сочетание вирусной доставки с фармакологическими средствами. В модели мышей DAT-KO использовали комбинированную доставку двух AAV-векторов: в черную субстанцию вводили AAV2/10 с Cre-рекомбиназой под промотором тирозингидроксилазы и AAV2/10 с Cre-зависимой кассетой экспрессии для крысиного DAT. Такой подход обеспечивал экспрессию DAT только в TH-позитивных нейронах. К 48-му дню после инъекции отмечалось снижение гиперлокомоции в тесте открытого поля, нормализация показателей в тесте вертикального шеста, а также восстановление параметров походки. Биохимический анализ показал частичное восстановление захвата дофамина и нормализацию соотношения метаболитов дофаминергической и серотонинергической систем [44].

Аналогичная терапия с двухвекторной AAV-системой, проведенной взрослым мышам, подтвердил устойчивость эффекта. При этом экспрессия тирозингидроксилазы сохранялась без нежелательной активации в других структурах, таких как голубое пятно [44][45].

LV-векторы применяются в генной терапии дефицита DAT преимущественно в in vitro моделях, основанных на iPSC, дифференцированных в дофаминергические нейроны среднего мозга. В таких системах LV используют для коррекции мутаций в целевом гене, вызывающих потерю функции DAT. Трансдукция LV-векторов восстанавливает захват дофамина, снижает апоптоз и повышает выживаемость TH-позитивных клеток. Комбинация LV с ингибитором белка Hsp70 усиливает эффект, повышая захват дофамина на 50–100 % и снижая уровень апоптоза до 20–30 % от контрольного. Однако при некоторых мутациях эффект определяется преимущественно вирусной трансдукцией [43]. В in vivo моделях, включая мышей DAT-KO, LV применяются реже, но демонстрируют потенциал для селективной экспрессии в дофаминергических нейронах и восстановления двигательных функций [45].

По сравнению с AAV-системами LV-векторы обеспечивают более стабильную интеграцию в геном хозяина, но связаны с риском инсерционного мутагенеза, что ограничивает их клиническое применение [46]. При этом анализ доступных данных показывает, что основные направления исследований сосредоточены на AAV благодаря их низкой иммуногенности и высокой эффективности в ЦНС отдельных серотипов (AAV2, AAV5, AAV8, AAV9) [47][48]. Исследования с применением других вирусных платформ (в частности, аденовирусных или герпесвирусных) для коррекции дефицита DAT пока отсутствуют, что подчеркивает ограниченность текущей экспериментальной базы.

Обсуждение и заключение. В литературе накоплен значительный объем данных о дофаминовой дисфункции, эпигенетических механизмах и подходах к генной терапии на модели DAT-KO у крыс, которые удалось систематизировать. Вместе с тем полнота картины ограничена несколькими факторами: гомозиготные модели используются в исследованиях значительно чаще, чем гетерозиготные, что ограничивает понимание всего спектра последствий частичной дисфункции DAT. Данные о динамике эпигенетической регуляции дофаминового транспортера остаются фрагментарными [32][34], а доклинические исследования генной терапии не подкреплены достаточным числом работ по долгосрочной безопасности [39][42].

Проведенный обзор показал, что гомозиготные модели с нокаутом гена DAT позволяют воспроизводить отдельные аспекты нарушений дофаминергической передачи [1][5]. В то же время полное отсутствие функционального транспортера отражает крайний вариант патологии, тогда как гетерозиготные особи демонстрируют промежуточные фенотипические проявления, что повышает ценность их параллельного изучения.

Кроме того, нейроанатомические и поведенческие изменения у нокаутов могут отражать как прямые последствия дефицита DAT, так и вторичные компенсации в других нейромедиаторных сетях [49]. Следовательно, для разделения первичных и вторичных эффектов необходимы мультимодальные подходы: высокопольная МРТ для количественной морфометрии, целевые транскриптомные и протеомные анализы для выявления каскадов компенсаторных изменений, а также временная оценка фенотипов в разном возрасте. Эпигенетические данные по регуляции SLC6A3 вносят важное, но пока фрагментарное дополнение к пониманию дофаминергической дисфункции. Отдельные исследования указывают на гиперметилирование промотора SLC6A3 при болезни Паркинсона и на возрастно-зависимые изменения метилирования и модификаций гистонов в моделях на грызунах [38][39]. Однако эти разрозненные данные не позволяют выстроить единую картину, поскольку для этого необходимо установить точное соответствие между эпигенетическими маркерами, экспрессией DAT и клинической картиной.

В свою очередь, перспективы терапевтической коррекции дефицита DAT выглядят обнадеживающе. AAV-опосредованная доставка Slc6a3 показала дозозависимое восстановление двигательных параметров в моделях животных [43][44][45]. Однако применение AAV-векторов имеет некоторые трудности в виде узкого терапевтического окна по времени и дозе [46], что требует точной оптимизации параметров введения и пространственно-временного контроля экспрессии трансгена.

Параллельно двухвекторные подходы для обеспечения селективной экспрессии в TH-нейронах и LV-стратегии для in vitro коррекции у iPSC демонстрируют функциональную эффективность [43]. Но LV-векторы априори менее безопасны относительно AAV [48]. В связи с этим приоритет исследований должен быть направлен на оптимизацию таргетинга, контроля уровня экспрессии и длительного мониторинга побочных эффектов.

Таким образом, модель крыс с нокаутом гена Slc6a3 представляет собой ценную экспериментальную модель для изучения патофизиологии дофаминергических нарушений. Ее высокая степень гомологии с человеческим геном SLC6A3 обеспечивает воспроизводимость ключевых фенотипов, включая гипердофаминергию, моторные и когнитивные нарушения, что делает ее релевантной для исследования СДВГ, шизофрении, болезни Паркинсона и синдрома дефицита DAT.

Перспективные стратегии генной терапии, основанные на применении AAV- и LV-векторов, демонстрируют высокую эффективность в восстановлении функций DAT и коррекции двигательных и поведенческих нарушений в экспериментальных моделях. Однако специфика генной терапии с использованием вирусных векторов, в частности, сохранение узкого терапевтического диапазона доз и необходимость предотвращения побочных эффектов, а также ограниченность имеющихся данных указывает на важность дальнейших исследований.